摘要：目的:建立人截短型胰岛素样生长因子1的原核高效表达系统。方法：利用基因重组技术将人截短型胰岛素样生长因子1〔Des（1-3）IGF1〕的cDNA片段克隆到融合蛋白表达载体pMTY4中，用离子交换层析法纯化蛋白并经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射免疫检测、N-末端前16位氨基酸序列测定及生物活性检测等方法对所获蛋白进行了鉴定。结果：获得含人Des（1-3）IGF1基因的重组质粒，在大肠杆菌中高效表达出含凝血酶识别序列的MS2-Des（1-3）IGF1融合蛋白，该蛋白经凝血酶消化后纯化可获得与天然型一致的人Des（1-3）IGF1。结论：该方法是获得人重组Des（1-3）IGF1的有效途径，对进一步研究Des（1-3）IGF1有重要意义。

分类号：R392.11

High-level expression of human truncated insulin-like growth factor 1 in E.coli

LI Ying

（Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083）

DENG Hong-Ye

（Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083）

DI Chun-Hui

（Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083）

Abstract：Objective: To establish an efficient expression system for human truncated insulin-like growth factor 1 〔Des（1-3）IGF1〕as fusion protein in Escherichia coli（E.coli）.Methods: The cDNA of Des（1-3）IGF1 was cloned into an fusion protein expression plasmid, pMTY4, using gene recombinant technique. The protein was purified by ion exchange chromatography and identified by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, radioimmunoassay（RIA）, N-terminal amino acid sequence and biological activity.Results: A prokaryotic expression vector was constructed and the fusion protein containing MS2 polymerase fragment, thrombin recognition site and human Des（1-3）IGF1 was expressed in E.coli at high level. It was showed that the purified recombinant Des（1-3）IGF1 released from the fusion protein after digestion with thrombin was identical to the native Des（1-3）IGF1.Conclusion:This is an effective method for obtaining human recombinant Des（1-3）IGF1 and it is very important for further study of Des（1-3）IGF1.

Key words：Truncated insulin-like growth factor 1E.coliHigh-level expression▲

胰岛素样生长因子1（IGF1）是70个氨基酸组成的多肽生长因子，具有胰岛素样效应和促进细胞生长的作用，对某些特定细胞有促进分化成熟的功能。Des（1-3）IGF1是体内天然存在的IGF1的截短形式，其N端缺失3个氨基酸Gly-Pro-Glu。实验证明，Des（1-3）IGF1刺激培养细胞增殖的能力较IGF1高10倍以上^［1］ 。国外已有通过化学合成、组织提取、真核细胞表达及大肠杆菌分泌性表达获得Des（1-3）IGF1的报道，但表达量均较低^［2-5］。本文利用融合蛋白表达技术，成功地在大肠杆菌中高效表达了MS2-Des（1-3）IGF1融合蛋白，经过凝血酶消化、离子交换层析获得了天然型序列的Des（1-3）IGF1，为进一步研究Des（1-3）IGF1的结构与功能打下了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株 大肠杆菌POP2136 （C600衍生株，含CI857基因，编码温度敏感的λ阻遏蛋白），由Raidoud博士惠赠；DH5αF'IQ^TM 购自GIBCOL/BRL公司。

1.1.2质粒 pGEM5zf和 pGEM3zf（+）质粒购自Promega公司；pBR322-IGF1质粒由北京医科大学心肺内分泌研究中心汤健教授惠赠；融合蛋白表达载体pMTY4为本室构建，它含有编码MS2聚合酶片段和凝血酶识别位点的基因^［6］。

1.1.3试剂 各种限制性内切酶、DNA修饰酶、核苷酸dNTP、ATP购自Promega公司、GIBCOL/BRL公司、华美公司等； Wizard^TM minipreps PCR product purification system and DNA purification system购自Promega公司；测序样品处理试剂盒Auto cycle^TM sequencing kit购自Pharmacia公司；凝血酶购自中科院血研所；Q Sepharose XL和CM柱填料购自瑞典Pharmacia公司。

1.2方法

1.2.1人Des（1-3）IGF1原核表达质粒的构建 根据文献已公布的IGF1 cDNA序列，设计了第1对上游引物5'ACG CTC TGC GGG GCT GAG 3'和下游引物5' GTAAGCTTA AGC TGA CTT GGC AGG 3'。在下游引物中导入HindⅢ酶切识别位点（划线部分），以pBR322-IGF1为模板，在Stratagene 9600 PCR仪上扩增，将获得的Des（1-3）IGF1 PCR产物用Klenow酶处理以切去3'突出A，并纯化它。为了在下游引物的HindⅢ酶切位点后增加保护性碱基，将pGEM5zf用EcoRV处理，并与上述纯化的PCR产物连接，利用Des（1-3）IGF1上游引物和pUC/M13 Reverse引物作为第2对扩增引物，以上述连接产物为模板，进行PCR扩增。并将PCR产物依次用Klenow 和Hind III 处理，与已用StuI和Hind III处理的pMTY4载体连接，获得pMTY4-Des（1-3）IGF1表达载体。

1.2.2核酸序列测定 pMTY4-Des（1-3）IGF1质粒用EcoRI、HindⅢ双酶切，将释放片段克隆到pGEM3zf（+）质粒中，用ALF^TM DNA Sequencer（Pharmacia biotech）测序仪测序，测序反应按操作说明进行。所用酶及其他试剂均由Pharmacia biotech提供。

1.2.3质粒的转化、筛选、诱导及细菌包涵体的获得 按文献［7，8］所述方法进行。

1.2.4蛋白的纯化 将初步纯化的包涵体于变性液（50 mmol/L Tris^.HCl pH8.5, 8 mol/L Urea, 20 mmol/L β-巯基乙醇）中，37℃，0.5h，高速离心（16 000r/min 15 min），并将离心上清用50 mmol/L Tris^.HCl （pH8.5） 稀释至8～10倍体积，按5 U/mg蛋白加入凝血酶, 27℃ 17h后，依次经过Q Sepharose XL阴离子交换层析柱和CM阳离子交换层析柱，收集各吸收峰进行Tris-Tricine缓冲系统的SDS-PAGE电泳。

1.2.5表达产物的放射免疫学检测（RIA） rhIGF1标准品购自Promega公司，兔抗IGF1抗血清UB3189由北卡罗来那大学 Ungerwood 和VanWyk博士通过美国糖尿病消化病肾脏病协会惠赠。 Indogen （1,3,4,6-tetrachloro-3α6α-diphenylglycoluril）购自Sigma公司，rhIGF1的碘化标记方法见文献［9］，RIA方法见文献［10］。

1.2.6氨基酸序列分析 将纯化的蛋白样品送交中国医学科学院基础所测定N-末端前16位氨基酸。

1.2.7生物学活性测定以NIH3T3为检测细胞株，用Pepro Tech EC 公司的IGF1 作标准品，MTT掺入法测定生物学活性。

2结果

2.1Des（1-3）IGF1基因的PCR扩增 根据已设计的2对引物分别进行PCR，得到210 bp和336 bp的片段，如图1所示，同预期大小一致。

图1人Des（1-3）IGF1基因的2次PCR扩增结果

Fig. 1Electrophoretic result of human Des（1-3）IGF1 gene amplified by PCR

Note:1. PCR markers：1 543，994，697，514，377，237 bp; 2. product using the first two primers; 3. product using the second two primers

2.2pMTY4-Des（1-3）IGF1表达质粒的构建及初步鉴定 重组质粒按图2所示构建。通过转化、筛选，获得pMTY4-Des（1-3）IGF1质粒, PCR鉴定及NarI酶切鉴定都与预期结果一致（图略）。

图2表达质粒pMTY4-Des（1-3）IGF1的构建图谱

Fig.2The construction scheme of expression plasmid pMTY4-Des（1-3）IGF1

2.3pMTY4-Des（1-3）IGF1表达载体中目的基因序列分析 将pMTY4-Des（1-3）IGF1质粒中凝血酶识别位点及Des（1-3）IGF1基因克隆至载体pGEM3zf（+）中进行序列测定，分析结果与已公布的序列完全一致^［2］。

2.4融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化 SDS-PAGE分析结果如图3所示，工程菌pMTY4-Des（1-3）IGF1/ POP2136的主要表达产物为18.2 kD左右的分子，凝血酶消化产物分别与MS2（11 kD）和Des（1-3）IGF1（约7.2 kD）的大小一致。通过凝胶成<