摘要：目的：探讨ICAM-1反义寡核苷酸对小鼠肾小管上皮细胞表达ICAM-1的影响，为利用ICAM-1反义寡核苷酸类药物治疗肾小管间质病变奠定基础。方法：小鼠ICAM-1反义寡核苷酸及其对照物参照文献合成并行全硫代磷酸化修饰。部分ICAM-1反义寡核苷酸在其5′端作FITC荧光标记。将ICAM-1反义寡核苷酸单独或脂质体转染试剂DOTAP混合后转染至培养的肾小管上皮细胞之中，转染成功后加入IL-1β诱导细胞产生ICAM-1。采用对照寡核苷酸及不含寡核苷酸的细胞转染液作为实验对照及空白对照。利用免疫组化染色的方法检测细胞ICAM-1表达变化并提取细胞总RNA行逆转录PCR及Northern杂交观察ICAM-1 mRNA的表达的变化。结果：两个不同浓度的ICAM-1反义寡核苷酸均可明显阻断IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA的表达；对照的寡核苷酸不能减少IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA的表达。结论：小鼠ICAM-1反义寡核苷酸可明显抑制IL-1β诱导的小鼠肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA 的表达，提示ICAM-1的反义寡核苷酸有可能应用于肾小管间质病变的实验治疗之中。

分类号：R692.6

Inhibition of ICAM-1 expression in renal tubular epithelial cells with ICAM-1 antisense oligodeoxynucleotide

CHENG Qing-Li

（Department of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853）

CHEN Xiang-Mei

（Department of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853）

FU Bo

（Department of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853）

Abstract：Objective：The blocking effects in ICAM-1 antisense oligodeoxynucleotide （ASON） on the ICAM-1 expression of renal tubular epithelial cell was investigated to probe the potential applicability of the ASON drug in renal tubulointerstitial diseases.Methods:The mouse ICAM-1 ASON was transducted into the mouse renal tubular epithelial cells with the presence of liposome DOTAP.Another oligodeoxynucleotide,which has the same base composition as the ICAM-1 ASON but a different sequence,was also transfected into the cells as a control.ICAM-1 expression of the epithelial cells was induced by interleukin-1.The changes of ICAM-1 protein expression by the cells were measured by immunohistochemistic stainging with anti-ICAM-1 antibody.ICAM-1 mRNA expression of the epithelial cells was examined by RT-PCR and Northern blotting methods.Results：①ICAM-1 ASON inhibited the ICAM-1 and ICAM-1 mRNA expressions of the epithelial cells induced by IL-1 at dosages of both 100 and 200 nmol/L.②The control oligodeoxynucleotide has no effect on the ICAM-1 expression of the epithelial cells.Conclusion:These data demonstrate that ICAM-1 ASON can selectively inhibit the ICAM-1 expression of the cells.It suggests that the ICAM-1 ASON might be applied in treatment of renal tubular interstitial diseases.

Key words：ICAM-1AntisenseEpithelial cellTransfectionKidney▲

细胞间粘附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）是介导细胞与细胞之间粘附的重要生物分子，其在机体的炎性病变中起着十分重要的作用。目前的研究发现ICAM-1的拮抗物可以有效地阻断ICAM-1介导的细胞间的粘附及炎症发生^［1，2］。近几年，随着反义寡核苷酸类药物的开发成功，利用ICAM-1反义寡核苷酸类药物阻断细胞内ICAM-1 mRNA的表达，抑制体内ICAM-1的过度表达，已见文献报道^［3，4］，但ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞表达ICAM-1的影响尚未有研究报道。国外的研究和我们的前期研究均表明肾小管上皮细胞在缺氧^［5］、缺血及炎症因子^［6］的诱导下细胞膜上ICAM-1的表达可以明显增强，缺氧损伤的上皮细胞进而还可诱导肾小管间质成纤维细胞的增殖及ICAM-1表达的增强^［7］，这些病理生理改变在肾小管间质炎症病变及间质纤维化病变中起着十分重要的作用。为利用ICAM-1反义寡核苷酸类药物实验性治疗肾小管间质病变，本研究探讨了ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞表达ICAM-1的影响。

1材料与方法

1.1材料NIH雌性小鼠，重18～22 g，由解放军总医院医学实验动物中心提供。小鼠ICAM-1反义寡核苷酸及其对照物均由Cybersyn公司合成并行全硫代磷酸化修饰。小鼠ICAM-1反义寡核苷酸及其对照物的序列参照文献［3］合成。小鼠ICAM-1反义寡核苷酸序列为：5’-TGCATCCCCCAGGCCACCAT-3’；其对照物的序列为：5’-TCGCATCGACCCGCCCACTA-3’。IL-1β（10 000 U/ml）为邦定公司产品。细胞转染试剂DOTAP为Boehringer Mannheim公司产品。小鼠ICAM-1的3条引物序列分别为：Sense:5’-CAACTGGAAGCTGTTTGAGCTG-3’；Antisense 1:5’-TAGCTGGAAGATCGAAAGTCCG-3’；Antisense 2:5’-GTGTTCACAGTCTTGCTCCAT-3’。Antisense 1与Sense扩增片段为437 bp，Antisense 2与Sense扩增的片段数为1 567 bp。RNA提取试剂Trizol为GIBCO BRL公司产品，逆转录试剂盒及PRC试剂均为Promega公司产品，脱氧胞苷5’-［α-³²P］ 三磷酸盐（α-³²P-dCTP）由北京亚辉生物医学工程公司提供。

1.2方法

1.2.1细胞培养取NIH小鼠肾脏去包膜，剪下皮质，于80目不锈钢网筛上研磨、冲洗，在140目网筛上收集肾小管节段（纯度可达98%以上），经生理盐水冲洗2次后，将肾小管节段加入10%新生牛血清RPMI 1640培养液置于预铺1%明胶的5 ml培养瓶中培养，约5 d后可见肾小管贴壁，置换培养液继续培养至第10天可见肾小管上皮细胞长出，用0.1%胰酶/EDTA缓冲液消化传代培养3 d，取第1代肾小管上皮细胞作细胞转染实验。

1.2.2细胞转染将ICAM-1反义寡核苷酸与脂质体转染试剂DOTAP按1∶1（重量之比）的比例分别加入至Hepes缓冲液（20 mmol/L，pH7.4）中，配制成ICAM-1反义寡核苷酸的浓度为0.1 μg/μl的细胞转染液。将上述已制备成功的小鼠肾小管上皮细胞的培养液更换为1%新生牛血清RPMI 1640培养液后加入细胞转染液，使每瓶细胞培养液中ICAM-1反义寡核苷酸的最终浓度为100或200 nmol/L。另外按相同的方法加入对照物寡核苷酸及不含寡核苷酸的细胞转染液作为实验对照及空白对照。

1.2.3细胞ICAM-1表达的诱导上述细胞转染4 h 后，弃上清，更换为10%新生牛血清RPMI 1640培养液继续培养4 h后，加入人重组的IL-1β于细胞培养液中（终浓度为10 U/ml），刺激培养12 h，诱导细胞产生ICAM-1。

1.2.4细胞RNA的提取及定量上述各组细胞在刺激培养12 h后，弃上清，加入Trizol试剂1.0 ml瓶，氯仿抽提后，用异丙醇沉淀，沉淀的RNA用70%乙醇洗涤后，溶于DEPC水中，利用紫外分光光度计测定RNA溶液的光密度值，计算RNA的浓度。

1.2.5逆转录PCR观察ICAM-1 mRNA的表达情况取抽提的RNA 5μg，按试剂盒的说明分别加入10 pmol Oligo dT、20 mmol/L dNTP、0.1 mol/L DTT及逆转录酶后于37℃水浴2 h，100℃灭活、变性3 min后，取2 μl逆转录产物，分别加入两对引物后进行热启动扩增，PCR扩增的条件分别为94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 45 s 共30个循环（437 bp）及94℃ 60 s，60℃ 60 s，72℃ 2 min共30个循环（1 567 bp），PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，观察ICAM-1 mRNA的表达情况。

1.2.6Northern杂交检测ICAM-1 mRNA的变化取20 μg RNA，甲醛变性凝胶电泳后转移至尼龙膜上，紫外线固定后，预杂交2 h，利用PCR扩增产物制备的ICAM-1 cDNA探针，α-³²P-dCTP标记探针，杂交16 h后放射自显影观察细胞中ICAM-1 mRNA的变化。

1.2.7免疫组化检测ICAM-1表达改变将培养的原代肾小管上皮细胞消化传代后接种至24孔细胞培养板中，细胞接种密度为3×10⁴/孔，将细胞分为12组，每组有3孔细胞，按方法1.2.2进行细胞转染实验，并设立不加脂质体、直接用100和200 nmol/L的寡核苷酸转染细胞，观察脂质体在细胞转染中的作用。转染后的细胞以方法1.2.4诱导细胞产生ICAM-1，同时设定不转染反义寡核苷酸及不加IL-1β刺激诱导的细胞作为空白对照。肾小管上皮细胞刺激培养结束后，细胞以95%甲醇固定10 min，加入1%小牛血清室温下阻断培养2 h，再加入大鼠抗小鼠ICAM-1单克隆抗体，4℃过夜，以0.5%Tween/PBS缓冲液洗涤后，加入辣根过氧化酶标记的兔抗大鼠IgS，室温下孵育2 h，以0.5%Tween/PBS缓冲液洗涤后，以30%过氧化氢及邻苯二胺发色，在倒置显微室下观察细胞膜上ICAM-1表达的改变，同时设立不加一抗和不加二抗的细胞作为免疫组化实验的阴性对照。根据肾小管上皮细胞膜上着色的程度分为-、+、++、+++4个等级记录ICAM-1表达的变化。

1.2.8统计学处理计量资料的比较采用t检验，等级资料的