摘要：目的：对一种新发现的凋亡相关基因TFAR19进行蛋白质水平的促凋亡效应研究，并对其作用机理进行初步的探讨。方法：利用离子交换层析对大肠杆菌表达的人重组TFAR19蛋白进行纯化，将其加入到培养的白血病细胞株HL-60，通过DNA片段化、PI及Annexin V标记进行流式细胞仪分析，观察TFAR19蛋白的促凋亡效应。利用FITC标记TFAR19蛋白，分析其与细胞的结合及定位。利用Caspase-3抑制剂DEVD-fmk研究TFAR19的凋亡信号转导途径。结果：高纯度的重组TFAR19蛋白剂量依赖性地促进撤除血清的HL-60细胞的凋亡，最高可使82%细胞凋亡，对照为30%。荧光标记的TFAR19蛋白能与HL-60细胞结合，主要定位于细胞核。DEVE-fmk可部分抑制TFAR19蛋白的促凋亡效应。结论：TFAR19蛋白能够直接进入HL-60细胞，发挥其促进细胞凋亡的效应。这一效应部分地与Caspase-3的凋亡执行效应有关。

分类号：R371

The apoptosis-accelerating effect of human recombinant TFAR19 protein on leukemia HL-60 cells

ZHANG Ying-Mei

Laboratory of Medical Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083

XU Xiu-Zhen

Laboratory of Medical Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083

LIU Hong-Tao

Laboratory of Medical Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083

Abstract：Objective: To study the apoptosis-accelerating effect of a novel human protein named TFAR19 (TF-1 cells apoptosis related protein 19) whose encoding cDNA has been cloned in the laboratory, and try to find out the mechanism of its effect. Methods： By using ion exchange chromatography, the human recombinant TFAR19 protein was isolated. The purified protein was co-cultured with HL-60 cells and the apoptotic cells were analyzed by DNA fragmentation, PI and Annexin V-labeled FACS assay. The FITC labeled TFAR19 protein w used as probe to observe its localization within the HL-60 cells. For the signal transduction study, a caspase-3 inhibitor DEVD-fmk was used to block the TFAR19 effect. Results： The TFAR19 protein dose-dependently increases the apoptotic HL-60 cells which have been previously withdrawn serum from culture, up to 82% cells are apoptotic cells comparing with control 30% cells. FITC labeled TFAR19 protein binds with HL-60 cells and mainly localized within the nucleus. DEVD-fmk partly inhibits apoptosis-accelerating effect of the TFAR19 protein. Conclusion: TFAR19 protein can directly enter HL-60 cells and exhibits an apoptosis-accelerating effect. Caspase-3 as an apoptosis effector may involve the effect of TFAR19.

Key words：TFAR19ApoptosisHL-60 cellsCaspase-3▲

凋亡（Apoptosis）或程序化死亡是基因控制的细胞自我毁灭的过程，它在机体的发育和内稳定的维持中起着至关重要的作用^［1，2］。由于细胞凋亡为多阶段，多系统，多基因参与的复杂过程，目前对其参与的全部基因尚未了解清楚。本研究组在对红白血病细胞株TF-1细胞的凋亡相关基因研究中，曾经成功地克隆了一个新的凋亡相关基因的全长cDNA（GenBank登记号为AF014955），将其构建的真核表达载体转染TF-1等细胞后，可加速这些细胞的凋亡，证明其为凋亡相关基因并命名为TFAR19（TF-1cell apoptosis related gene），同时还证明其定位于细胞核^［3，4］。为进一步研究在蛋白质水平上TFAR19的作用，本工作重点探讨了重组TFAR19蛋白对白血病细胞的影响，并对其作用机理进行了初步探讨。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂ApoAlert^TM Apoptosis Kit, Caspase-3抑制剂DEVD-fmk购自Clontech公司。具有诱导凋亡效应的蛋白激酶抑制剂Staurosporin购自Sigma公司。

1.1.2菌种与细胞株质粒：pMTY4-TFAR19，本室构建^［3，4］，含PL启动子，可在大肠杆菌表达MS2-凝血酶接头-TFAR19融合蛋白，分子量约为25 kD，经凝血酶切割后可收获非融合的重组TFAR19蛋白，分子量约为14 kD。宿主菌：大肠杆菌pop2136（CI857温度敏感）为C600衍生菌，编码温度敏感λ阻遏蛋白，由Raiband博士惠赠。细胞株：HL-60细胞株为人早幼粒细胞系，本室保存。

1.2方法

1.2.1重组TFAR19蛋白在原核细胞中表达和纯化pMTY4-TFAR19可在pop2136菌株中以包涵体的形式经42℃诱导表达融合蛋白，收集细菌经超声裂解洗涤，制备成包涵体，在8 mol/L尿素，20 mmol/L Glysine-NaOH（pH10.0）中，37℃变性30 min，将变性液稀释至1 mol/L尿素复性，以HAc/NaAc(pH4.5)调复性液pH为8.5，凝血酶27℃孵育过夜，利用DEAE离子交换层析进行蛋白质纯化，20 mmol/L Glysine-NaOH/HAc NaAc(pH8.5)条件下上样，50 mmol/L Tris-HCl(pH8.9) NaCl梯度洗脱，在0.06 mol/L NaCl盐浓度洗脱下目的蛋白，SDS-PAGE分析重组蛋白的表达和纯度。

1.2.2重组TFAR19蛋白对HL-60细胞凋亡的影响HL-60细胞在含10%小牛血清RPMI 1640培养液中培养2 d后，离心收集细胞，用无血清1640洗涤细胞2次，以无血清1640调整细胞浓度为1.2×10⁶ ml^-1，放入24孔培养板中，实验孔分别加入纯化的TFAR19蛋白25、20、15、10、5 μg，对照孔加入与其实验孔等体积的PBS，放入37℃培养箱5%CO₂，16 h后收获，对凋亡细胞进行检测。

1.2.3细胞凋亡后DNA片段化的检测收集TFAR19蛋白作用后的HL-60细胞，加入裂解液及蛋白酶K，50℃，1 h，再加入RNAse 50℃，1 h，加入TE缓冲液，70℃条件下加入低熔点的1%Agarose，通过1.3%Agarose DNA电泳，观察凋亡细胞梯形条带的形成。

1.2.4凋亡细胞DNA含量的流式细胞仪分析TFAR19蛋白处理过的HL-60细胞经PBS洗涤2次，溶于PBS中加入RNAse(10 mg/ml)5 μl，37℃作用30 min，加入（10 mg/ml）碘化丙啶（PI，Propidium iodide）10 μl。用流式细胞仪测定细胞DNA结合PI的荧光强度，在DNA的荧光直方图中，分析前向角散射光强度（FCS）和侧向散射光强度（SSC），以确定凋亡细胞的百分数，并可同时进行细胞周期的分析。

1.2.5ApoAlert^TM试剂盒检测凋亡细胞收集重组TFAR19蛋白处理后的HL-60细胞PBS洗3次后，用200 μl 1×Binding Buffer悬起，加入5 μl Annexin V-FITC，5 μl PI，室温避光放置15～20 min，加入400 μl PBS，利用流式细胞仪488 nm波长分析细胞凋亡数量和凋亡程度。除设定PBS组对照外，还设定一组凋亡诱导剂Stuaurosporin作为阳性对照。

1.2.6Caspase-3抑制剂DEVD-fmk阻断效应检测HL-60细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基培养48 h，以Hank's液洗涤后铺入96孔细胞培养板，分为4组，一组加入PBS，一组加入TFAR19蛋白，两组加入DEVD-fmk（终浓度30 μm）。每组3个复孔，5%CO₂ 37℃培养1 h后离心弃去DEVD-fmk，分别换成PBS及TFAR19蛋白，并一律用无血清RPMI 1640培养基5%CO₂ 37℃培养16 h。各孔取等量细胞加入伊红Y，光学显微镜下记录死细胞数目。

1.2.7FITC标记TFAR19蛋白和细胞定位研究FITC以一滴DMSO溶解后加入0.5 ml碳酸盐Buffer（pH9.5）加入纯化后的TFAR19蛋白混匀，装入透析袋，用碳酸盐Buffer磁力搅拌，4℃透析，取出后，过Sephadex G25柱，以碳酸盐Buffer平衡，上样后以0.01 mol/L PBS(pH7.6)洗脱，收集结合FITC的大分子TFAR19蛋白。将洗涤后的HL-60细胞溶于100μl PBS中，加入100μl TFAR19-FITC，4℃作用30 min，冷PBS洗后，滴片，荧光显微镜下观察。

2结果

2.1重组TFAR19蛋白的纯化重组TFAR19蛋白经包涵体洗涤、变性、复性、阴离子交换层析后，可获得95%以上纯度的蛋白，图1可见两批纯化蛋白的结果。

图1人重组TFAR19蛋白的大肠杆菌表达和纯化

Fig.1The purification of rhTFAR19 expressed in E.coli

Note:a.Bacterial sample before induction;b.Bacterial sample after induction;c.The IBS;d.Protein marker;e.f.The purified rhTRAF19

2.2重组TFAR19蛋白对HL-60细胞的促进DNA片段化的效应通过DNA片段化的分析，证明重组TFAR19蛋白对撤除血清诱导凋亡的HL-60细胞有明显的促凋亡效应，见图2。