摘要目的：研究不同肿瘤细胞表面血小板免疫相关抗原的表达。方法：利用流式细胞术观察了PGCL3、PAa、PG-3、PG-3M、MGC803、ESCL、Bel、HCT、KB、A2780、CC801共11种人肿瘤细胞，其中包括二对高低不同转移能力的人肺癌（PGCL3和PAa）和人前列腺癌（PG-3和PG-3M）细胞阳性表达不同血小板免疫相关抗原的细胞数及其肿瘤细胞表面抗原表达的平均荧光强度。结果：11种人肿瘤细胞膜表面均有CD9、CD63、CD42a和TSP等血小板免疫相关抗原不同程度的表达，在MGC803细胞膜表面发现有CD36较强的表达，CD41、CD42b、CD61和CD62均未发现表达。11种人肿瘤细胞系中CD9⁺、CD42a⁺、CD63⁺、TSP⁺细胞所占的比例各不相同，不同肿瘤细胞系每个抗原阳性细胞抗原表达的荧光强度也不同。与高转移PGCL3和PG-3M细胞相比，CD9在低转移细胞系PAa和PG-3上有较高的表达，CD42a、TSP有相对低的表达。CD42a⁺和TSP⁺细胞数和表达强度在高转移PGCL3和PG-3M细胞系均要高于低转移的PAa和PG-3；CD63⁺细胞数高转移PG-3M细胞系要比低转移的PG-3高很多。结论：结合既往研究，肿瘤细胞表达的血小板免疫相关抗原可能与肿瘤细胞的侵袭转移能力有关。CD42a 、TSP和CD36过度表达可能促进肿瘤细胞的侵袭和转移，CD9和CD63（尤其是CD9）可能起相反的作用。由于MGC803同时表达CD36，它可能是11种肿瘤细胞中侵袭转移能力最强的。

中国图书分类号R392.11

Measurement of the antigens immunologically related to the platelet glycoproteins on tumor cells surface by flow cytometry

ZHANG Pei-Tong,PIAO Bing-Kui,PEI Ying-Xia et al.

Flow Cytometry Laboratory,Guanganmen Hospital,China Academy of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100053

Abstract Objective：To investigate the expression of the antigens immunologically related to the platelet glycoproteins on various human tumor cells surface. Methods：To measure and compare the expression of the antigens immunologically related to the platelet glycoproteins on 11 human tumor cell lines by flow cytometry. Particularly analyzing the results of two pairs of human pulmonary and prostatic tumor cell lines with low and high metastatic potential respectively. Counting the number and measuring the mean fluorescent intense of the antigen positive cells. Results：The expression of the fluorescent intensity and the number of the positive cells of CD9, CD63, CD42a and TSP on these tumor cell lines were different. MGC803 express CD36 except for CD9, CD63, CD42a and TSP. There were not expression of CD41, CD42b, CD61 and CD62 on 11 tumor cell lines. The positive cell number and fluorescent intensity of CD9 on the tumor cell lines PGCL3 and PG-3M with high metastatic potential is lower than that on PAa and PG-3 with low metastatic potential. The positive cell number and fluorescent intensity of CD42a, TSP, CD36 molecule expressed on PAa and PG-3 cells with low metastatic potential is less than that on PGCL3 and PG-3M. Conclusion：The expression of the antigens immunologically related to the platelet glycoproteins on tumor cells surface relate to the tumor invasion and metastasis. The over expression of CD42a, CD36 and TSP on tumor cell surface may promote tumor invasion and metastasis. CD9 and CD63, especially CD9 inhibit the invasion and metastasis. MGC803 express not only CD42a and TSP, but also CD36, it may have the most powerful invasive behavior among 11 tumor cell lines.

Key wordsFlow cytometryAntigen immunologically related to the platelet glycoproteinInvasion and metastasis, neoplasomaTumor cell line, culture

肿瘤细胞与血小板相互作用是肿瘤发生转移的关键步骤，血小板与肿瘤细胞通过各自浆膜表面表达的糖蛋白受体及其配基的连接作用，促进肿瘤细胞、血小板、内皮细胞、内皮下基质间的相互作用和相互激活，并利用细胞间的相互粘附及其释放的生物活性介质来影响肿瘤细胞的转移过程。我们通过了解不同肿瘤细胞表面表达的与血小板具有共同抗原性的糖蛋白分子，试图解释肿瘤细胞的侵袭转移机理。

1材料与方法

1.1材料IgG1 FITC (679.1Mc7)、IgG1 PE (679.1Mc7)、IgG2a FITC(U7.27)、CD9 FITC (ALB6, IgG1)、CD31 FITC（5.6E,IgG1）、CD36 FITC (FA6.152, IgG1)、TSP PE (P10,IgG1)、CD61 FITC (RUU-PL 7F12，IgG1)、CD41 PE (P2, IgG1)、CD42a FITC(SZ1,IgG2a)、CD42b PE (SZ2,IgG1)、CD63 FITC (CLBGran/12,IgG1)、CD62 PE (CLB Thromb/6, IgG1)。除CD61 FITC来自美国BD公司，其余抗体均来自法国Immunotech公司；RPMI1640来自GIBCO；牛血清白蛋白来自Sigma。人肺巨细胞癌PGCL3 (高转移细胞系)、人肺腺癌PAa (低转移细胞系)、人前列腺癌PG-3M (高转移细胞系)和PG-3 (低转移细胞系)来自北京医科大学基础医学院病理学系；人食管癌ESCL、人肝癌Bel、人结肠癌HCT、人鼻咽癌KB、人卵巢癌A2780来自中国医学科学院药物研究所肿瘤药理研究室；人宫颈癌CC801、人胃癌MGC803来自中国医学科学院基础医学研究所病理研究室。FACSort流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.2方法各种肿瘤细胞用0.02% EDTANa₂消化，以D-Hank′s液 (pH7.4) 吹打收集细胞，以0.5% 的PBA (PBS牛血清白蛋白) 洗2遍，重悬于0.5％PBA溶液中。以CD41 PE、CD61 FITC、CD42a FITC、CD42b PE、CD36 FITC、TSP PE、CD9 FITC、CD31 FITC、CD62 PE、CD63 FITC按常规方法标记染色，对照管采用IgG1 FITC、IgG2a FITC或IgG1 PE。细胞终浓度为10⁵～10⁶个/ml，抗体浓度为0.2 mg/ml。在室温暗处标记反应30 min后，以0.5% PBA洗1遍，用终浓度0.1％PFA固定，置4℃ 冰箱贮存待测，上机前过200目尼龙筛网，每个试验重复2～3次，每个样品收集10⁴个细胞。另外，还将PGCL3和PAa细胞分别用终浓度为0.1、0.5、1.0 U/ml的凝血酶和2×10^-4 mol/L的ATP在37℃刺激20 min，洗2遍，按常规染色，上机测试。

1.3流式细胞仪测试条件FSC电压E-1，增益6.14，线性；SSC电压320，增益1.00，线性；FL1电压400，对数；FL2电压340，对数；激光功率15 mW，激发光波长488 nm。校正机器后，先以前向角和侧向角散射光形成的散点图设定收集门，以固定条件收集样本。每个样品管收集10⁴个肿瘤细胞后进行分析。采用Macintosh Quadra 650计算机和Cell Quest软件收集处理样品数据。

2结果

2.1在PGCL3、PAa、PG-3M、PG-3、MGC803、ESCL、Bel、HCT、KB、A2780、CC801等11种肿瘤细胞上均发现有CD9、CD63、CD42a和TSP不同程度的表达，在MGC803上还发现有CD36较强的表达，但其余被检测抗原均未发现表达(见图1)。PGCL3与PAa细胞采用凝血酶及ADP刺激 (凝血酶的刺激可以增加肿瘤细胞CD41的表达^［1］，后也未显示CD41、CD42b、CD61、CD36和CD62的表达。

图1MGC803 细胞所表达的血小板免疫相关抗原

Fig.1The expression of antigens (CD9, CD36, CD42a, CD63 and TSP) immunologically related to the platelet glycoproteins on MGC803 (dot line, negative control; real line, MGC803 cells)

2.2在被研究的11种人肿瘤细胞系中CD9⁺、CD63⁺、CD42a⁺、TSP⁺细胞的比例各不相同，不同肿瘤细胞系的每个抗原阳性细胞表达的抗原分子数量也不同。在对二组不同转移能力的细胞系，PGCL3/PAa和PG-3M/PG-3的检测中发现，高转移和低转移能力的细胞系在CD9⁺、CD42a⁺、CD63⁺、TSP⁺细胞的数目上和/或表达的平均荧光强度上有较为明显的不同，高、低转移细胞系各自有其基本类似的趋势，即CD9⁺细胞在低转移细胞系有较高的表达，CD42a、TSP有相对低的表达；CD63的表达在高低转移能力不同的二对细胞系略有所不同，在低转移细胞系PAa CD63的表达要比高转移细胞系PGCL3低，但低转移PG-3细胞系CD63的表达与高转移细胞系PG-3M差别不大（见图2和图3）。

图2PGCL3和PAa细胞血小板免疫相关抗原表达的对比