中国图书分类号R392.1

摘要目的：观察白细胞介素2 (IL-2)基因修饰的巨噬细胞IL-2动态分泌水平及对其表面分子的表达和抗原提呈能力变化的影响。方法：通过重组腺病毒介导，将IL-2基因转染至腹腔巨噬细胞，MTT法检测其IL-2动态分泌水平，FACS检测巨噬细胞表型，混合淋巴细胞反应法(MLR)测定巨噬细胞抗原提呈能力。结果：IL-2基因修饰4 h后巨噬细胞即可表达较高水平的IL-2，18～48 h之间的IL-2分泌处于高峰。IL-2基因修饰的巨噬细胞MHC-II、B7-1、B7-2和CD40表达增加，抗原提呈能力提高。结论：IL-2基因修饰的巨噬细胞能有效表达IL-2，与其功能密切相关的MHC-II、B7、CD40表达增加，其抗原提呈能力增强，本实验为巨噬细胞免疫治疗肿瘤提供了实验依据。

Effect of IL-2 gene modification on the phenotype and antigen

presentation of macrophages

QIU Shi,CAO Xue-Tao， ZHANG Ming-Hui et al

(Department of Urology,ChangZheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003)

AbstractObjective：To investigate if IL-2 could induce improvement of the function of macrophages.Methods：IL-2 gene was transfected into murine peritoneal macrophages by adenovirus.Levels of IL-2 in the supernatant of macrophages,and antigen presentation of maorophages were assayed.Results：IL-2 could be detected in the supernatant of macrophages 4 hours after transfection.24 hours later,the IL-2 production reached the top value which was 413.5 U/10⁶cells,while antigen presentaiton function of IL-2 gene-molecule remained unchanged ,the expressions of MHC-II，B7-1，B7-2 and CD40 on the IL-2 gene-modified macrophages increased greatly.Conclusions：IL-2 gene modification could augment the antigen presentation function of macrophages.Our data provided experimental basis for the immunotherahy of tumor with IL-2 gene-modifed macrophages.

Key wordsMacrophageInterleukin-2Gene modificationPhenotypeAntigen presentation

作为一种具有显著抗肿瘤作用的免疫效应细胞，巨噬细胞(Macrophage,MΦ)也同时具有抗原提呈功能，通过激活T细胞，使机体产生特异性抗肿瘤作用。巨噬细胞在提呈抗原时其本身并不直接分泌IL-2，而是激活Th，使之分泌IL-2，从而活化T细胞。在抗原提呈过程中，IL-2对T细胞增殖和活化至关重要，而IL-2对巨噬细胞作用报道极少。本室曾通过重组腺病毒的介导有效地将IFN-γ基因转入巨噬细胞^［1］，因此，我们利用此技术，将IL-2基因转入巨噬细胞，观察IL-2基因修饰的巨噬细胞IL-2动态分泌水平及对其表面分子和抗原提呈能力的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物与细胞株Balb/c小鼠，雄性，6～8周龄，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司；IL-2依赖性CTLL-2细胞株由本室常规传代；抗小鼠ICAM-1单抗杂交瘤细胞YN1.7.4(ATCC CRL1878)，抗小鼠I-A^b,d分子单抗杂交瘤细胞B21-2(ATCC TIB229)均购自ATCC。

1.1.2主要试剂携带小鼠IL-2基因的重组腺病毒载体Adexl CA mIL-2(简称Ad-mIL-2)、携带LacZ对照基因的重组腺病毒载体Adexl CA-RxZ(简称Ad-LacZ)由日本癌症研究会分子生物治疗研究部Hirofumi Hamada博士惠赠；IL-2标准品购自Genzyme公司；³H-TdR购自上海原子能研究所；荧光标记的羊抗大鼠IgG和羊抗小鼠IgG购自Gibico公司；抗小鼠B7-1、B7-2、CD40、H-2K^dD^d单克隆抗体，购自PharMingen。

1.2方法

1.2.1单抗的制备将杂交瘤细胞体外扩增后，接种至预先腹腔注射过1 ml Pristane(Sigma)的裸鼠腹腔(1×10⁶/鼠)，2 w后收取腹水，离心(5 000 r/min,10 min)弃沉淀，上清经饱和硫酸铵盐析，经Sephadex G25除盐，在经DEAE-Sepharose 4B离子交换层析得到纯度约90%的抗小鼠ICAM-1和I-A^b,d分子单抗，用于FACS分析巨噬细胞表面ICAM-I和I-A^b,d的表达。

1.2.2小鼠腹腔巨噬细胞的制备按常规方法^［1］。暴露腹膜，腹腔内注入5 ml预冷的无血清RPMI 1640灌洗，收集于冰浴试管中，洗3次，加入培养板，37℃孵箱中培养2 h后弃去上清，洗涤3次，可获得较纯的贴壁巨噬细胞。

1.2.3IL-2的基因修饰及表达检测将新鲜分离的腹腔巨噬细胞加至24孔板中(0.5×10⁶/孔)，置37℃，5%CO₂孵箱中孵育1 h，弃去悬浮细胞，用RPMI 1640洗3次，每孔按50 mol/L(Mutioplicity of infection)加入稀释的腺病毒0.25 ml，每5 min轻摇1次，使病毒与细胞充分接触，2 h后，弃去病毒液，补充RPMI 1640至1 ml，FCS终浓度5%，置37℃，5%CO₂孵箱中培养，转染4,18,24 h,1.5,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 d 后收集上清，采用IL-2依赖细胞株CTLL-2为检测细胞的MTT法检测IL-2分泌水平。

1.2.4巨噬细胞表面分子的FACS检测腺病毒介导IL-2基因修饰巨噬细胞36 h后，用预冷的PBS洗3遍，多种分子的单抗(H-2K^dD^d、I-A^b,d、FasL、ICAM-l、B7-1，B7-2、CD40)1 μg与5×10⁵ ml^-1巨噬细胞共悬于30 μl PBS中，在4℃暗室中放置30 min，PBS洗3遍，去除游离的单抗，加入荧光标记的二抗1 μg,4℃暗室孵育30 min，PBS洗3遍，重悬于300μl PBS中，流式细胞仪(FACScalubur,BD)检测荧光强度。

1.2.5巨噬细胞抗原提呈功能的检测采用混合淋巴细胞反应(MLR)检测巨噬细胞抗原提呈能力。取OVA皮下免疫2次的Balb/c小鼠的脾脏细胞，按常规方法选用尼龙毛柱制备纯化T细胞。将5×10⁵ T细胞按5∶1与预先经丝裂霉素C (20 μg/ml 37℃，1 h)灭活的巨噬细胞及OVA(1 mg/ml)在96孔培养板中混合培养3 d，终止培养前18 h每孔加入1 μ Ci ³H-TdR，收集细胞检测cpm值，结果用3复孔均值表示，以T细胞增殖反应的高低判断巨噬细胞抗原提呈能力的强弱。

1.2.6统计学处理采用未配对计量资料的t检验。

2结果

2.1IL-2基因修饰的巨噬细胞上清中IL-2的动态分泌水平用mIL-2基因转染新鲜分离的小鼠腹腔巨噬细胞(IL-2-ΜΦ)，同时设立LacZ基因转染对照组(LacZ-MΦ)和未处理的巨噬细胞对照组(MΦ)。从图1可见，IL-2基因修饰4 h后巨噬细胞即可从培养上清中检测到一定水平的IL-2，24 h达最高峰(413.5 U/10⁶ cells)，持续至48 h，此后逐渐下降，基因修饰后10 d仍可在其上清中检测到一定水平的IL-2(达148.6 U/10⁶cells)；而LacZ基因对照组和细胞对照组在整个观察期内未检测到IL-2，可见IL-2基因已成功地转入巨噬细胞并高效表达。

2.2IL-2基因修饰的巨噬细胞表面分子的检测从图2可见，IL-2基因修饰巨噬细胞36 h后，巨噬细胞表面分子Ia (MHC-II)、B7-1、B7-2、CD40显著增加，而H-2和ICAM-1的表达无明显变化，提示IL-2基因修饰后的巨噬细胞表面分子MHC-II、B7和CD40表达增加。

2.3IL-2基因修饰的巨噬细胞的抗原提呈能力结果如图3所示，与LacZ基因对照组和细胞对照组相比，IL-2基因修饰的巨噬细胞抗原提呈能力显著增强(P＜0.05)；而LacZ基因对照组和细胞对照组之间的巨噬细胞抗原提呈能力无明显差别。

图1IL-2基因修饰的巨噬细胞的IL-2动态分泌水平

Fig.1Levels of IL-2 in the supernatants of macrophages transfected with IL-2 gene

图2IL-2基因修饰的巨噬细胞表面相关分子的表达

Fig.2Expression of molecules on the macrophages transfected with IL-2 gene

Note: A:MΦ，B：LacZ-MΦ，C：IL-2-MΦ

图3IL-2基因修饰的巨噬细胞的抗原提呈能力

Fig.3Anitgen-presenting ability of IL-2 gene-modified macrophages

Note:A:MΦ，B：LacZ-MΦ，C：IL-2-MΦ