摘要目的：探索LPS对小鼠腹腔巨噬细胞小分子蛋白质磷酸化的影响。方法：利用同位素掺入、SDS-PAGE、放射自显影和蛋白质印迹(Western blot)、结合蛋白激酶抑制剂与激活剂的使用，研究LPS对巨噬细胞处理后小分子蛋白质磷酸化及其相关蛋白激酶对此磷酸化的影响。结果：14.2 kD蛋白质磷酸化被LPS强烈地促进；MAPK的表达量未见明显变化；TPK抑制剂三羟异黄酮(genistein)明显抑制上述磷酸化；PKA激活剂佛斯可林(forskolin)和Gi蛋白抑制剂百日咳毒素对上述磷酸化无明显影响。结论：LPS能促进14.2 kD蛋白质的磷酸化，此磷酸化可能依赖酪氨酸蛋白激酶(TPK)。

中国图书分类号R392.11

Lipopolysaccharide enhances a 14.2 kD protein phosphorylation

of murine peritoneal macrophages

LIU Yan,WANG Yin,CUI Zhao-Chun.

Department of Biochemistry,Dalian Medical University,Dalian 116027

AbstractObjective:This study is aimed at exploring the influence of LPS on the phosphorylation of small MW proteins in mouse peritoneal macrophages.Methods:Radioisotope incorporation,SDS-PAGE，autoradiography,Western blot and protein kinase inhibitor and activator were used.Results:LPS strongly enhanced the phosphorylation of a 14.2 kD protein; MAPK expression was not significantly influenced by LPS;the TPK inhibitor genistein significantly inhibited this phosphorylation;the PKA activator forskolin and Gi protein inhibitor pertussis toxin did not show influence on the 14.2 kD protein phosphorylation.Conclusion:LPS enhanced the phosphorylation of a 14.2 kD protein and this phosphorylation might be TPK-dependent.

Key wordsLipopolysaccharideMacrophageProtein phosphorylation

来自细菌胞壁的脂多糖(LPS)是巨噬细胞(Mφ)激活表达多种功能的强激活剂，它能激活Mφ表达诱导型一氧化氮合酶mRNA(iNOS-mRNA)和肿瘤坏死因子mRNA(TNF-mRNA)，并释放大量一氧化氮(NO)及TNF，后二者不仅是Mφ杀伤病原微生物及肿瘤细胞的主要效应分子^［1］，而且也是Mφ过度激活损伤组织细胞的主要致病分子^［2］。现已发现蛋白激酶C(PKC)、酪氨酸蛋白激酶(TPK)及蛋白磷酸酶是Mφ表达iNOS-mRNA或TNF-mRNA信息传递通路中的重要组分^［3，4］，因此研究蛋白质磷酸化是探索它们作用的靶蛋白的直接方式之一。文献曾报道LPS对完整Mφ蛋白质磷酸化的影响^［5］，也表明LPS增强完整Mφ蛋白质磷酸化(如38、45、67、103 kD等)。完整细胞蛋白磷酸化能反映细胞蛋白磷酸化的动态水平，但大量［³²P］Pi易遮盖电泳前沿小分子蛋白的磷酸化情况。本文重点观察Mφ溶解液中小分子蛋白质的磷酸化，发现LPS能增强14.2 kD蛋白磷酸化，该蛋白分子可能是LPS激活Mφ信息传递中的一个重要的调节分子。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂LPS、genistein、forskolin、百日咳毒素、佛波酯(PMA)及蛋白标准品皆购于Sigma;［γ-³²P］ATP(1 mCi/ml)，北京亚辉生物工程公司；［³²P］Pi(10 mCi/ml)，北京中国原子能研究所；新生小牛血清(NCS)，大连旅顺生物制品厂；RPMI 1640培基，GIBCO公司；多克隆MAPK-2(Mitogen-activated protein kinase-2,也称ERK-2)抗体由加拿大UBC大学Steven Pelech教授赠送；ABC药盒为美国Vector Lab.Inc.;其它试剂均为国产分析纯。

1.1.2动物纯系昆明种小白鼠，23～25 g,雌雄不限，本校实验动物室提供。

1.2方法

1.2.1Mφ的培养、鉴定及激活^［6］小白鼠腹腔注射4%巯基乙醇(TG)培基，1.5 ml/只，4 d后用含4%NCS的无Ca²⁺、Mg²⁺的Hank’s液灌洗，收集小鼠腹腔渗出细胞(PEC)。PEC用RPMI 1640全培基(含20%NCS，4 mmol/L L-谷氨酰胺，4 mmol/L Hepes,0.25%NaHCO₃，100 μg/ml青霉素，140 μg/ml链霉素)调成悬液，计数，按5×10⁶细胞/孔分配于6孔塑料培养板中，经贴壁培养得贴壁细胞，后者经Mφ酸性磷酸酶和非特异性酯酶鉴定，98%以上为Mφ。Mφ在受LPS不同时间(15，30，60 min)刺激后或分别用蛋白激酶特异抑制剂、激动剂及百日咳毒素预处理1 h后再受LPS刺激。各种Mφ处理完毕，用PBS洗3遍，然后加入细胞溶解液(0.5%TritonX-100,80 mmol/L β-磷酸甘油，20 mmol/L EGTA,14 mmol/L MgCl₂，1 mmol/L Na₃VO₃,10 mmol/L NaF,1 mmol/L PMSF,pH7.6)溶解细胞，11 000 r/min离心，收集上清，以考马氏亮蓝测定蛋白质含量，然后进行蛋白质磷酸化实验。

1.2.2Mφ细胞溶解液蛋白质磷酸化取50 μl细胞溶解液，加入蛋白质磷酸化缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl,40 mmol/L MgCl₂，3.5 mmol/L ATP)及4～5 μCi ［γ-³²P］ATP，终体积为65 μl,于37℃保温使磷酸化30 min，然后加入15 μl电泳样品缓冲液，放100℃水浴3 min 终止反应。以13%凝胶浓度进行SDS-PAGE，蛋白上样量为100 μg。电泳完毕，用考马氏亮蓝R250于50℃染色30 min，脱色1 h，观察电泳结果，然后滤纸吸干胶板再进行放射自显影。显影后的胶板可重新染色、脱色,以标准蛋白定蛋白质分子量。

1.2.3完整Mφ蛋白质磷酸化和Western blot鉴定MAPK-2^［5，7］二者的测定完全按文献进行。

2结果

2.1LPS增强Mφ的14.2 kD蛋白质磷酸化小鼠腹腔Mφ受LPS刺激或先用genistein等试剂预处理后再受LPS刺激，各组Mφ溶解液蛋白质磷酸化结果见图1。从图1中可知，LPS单独处理的Mφ溶解液中14.2 kD的蛋白质磷酸化比对照组显著地增强(Lane 5或Lane 1比较)，LPS的这种效应受TPK抑制剂genistein的抑制(Lane 5与Lane 4比较)，但不受PKA激动剂forskolin及Gi效应剂百日咳毒素的影响(Lane 5与Lane 2,3比较)。14.2 kD蛋白质密度扫描值与上述结论相一致。

图1LPS增强Mφ的14.2 kD蛋白质磷酸化

Fig.1LPS enhanced the phosphorylation of a 14.2 kD protein of Mφ

Note: TG-elicited Mφs were treated for 30 min with medium(lane 1) or with 1 μg/ml LPS(lane 5) or (with 1 μg/ml LPS after 1 h of pretreatment with 25 μmol/L of forskolin (lane 2),125 ng/ml pertussis toxin(lane 3),30 μmol/L of genistein (lane 4).The treated cells were washed and lysed.TritonX-100-soluble protein was prepared for protein phosphorylation as described in materials and methods.Fig.1 is a representative autoradigram of three experiments

2.2LPS增强Mφ的14.2 kD蛋白质磷酸化的时间过程Mφ受LPS不同时间刺激，然后测定LPS增强14.2 kD蛋白质磷酸化的最佳时间，结果见图2。图2显示LPS刺激Mφ 30 min，14.2 kD蛋白质的磷酸化强度最大，与相应对照组差别最大。LPS刺激Mφ1 h，14.2 kD蛋白质磷酸化与对照组相比无显著性。14.2 kD蛋白质密度扫描值支持上述结论。

图2LPS增强Mφ的14.2 kD蛋白质磷酸化的时间过程

Fig.2The time course of LPS-enhanced phosphorylation of a 14.2 kD protein of Mφ

Note:TG-elicited Mφs were treated with medium(lane 1,3,5) or with 1 μg/ml of LPS(lane 2,4,6)for various times.The steps that follow were as described in materials and methods.The fig is a representative autoradigram of three experiments

2.3LPS增强完整Mφ蛋白质磷酸化文献曾报道，LPS能激活Mφ的有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)。MAPK家族分子量在38.0～45.0 kD，其中MAPK-2的分子量为42.0 kD。LPS激活MAPK的最佳时间为15 min，MAPK被磷酸化后而激活，然后再磷酸化其靶蛋白而将信息下传^［7，8］。LPS增强14.2 kD蛋白质磷酸化的时间进程恰好处于MAPK激活状态之下，14.2 kD磷酸化是否是MAPK激活的结果呢?通过测定完整Mφ蛋白质磷酸化可观察到LPS增强38.0～45.0 kD蛋白质磷酸化，说明MAPK被激活，但14.2 kD蛋白质磷酸化情况被前沿³²P遮盖住了。用MAPK-2多克隆抗体也检测到MAPK-2的存在，但酶蛋白的表达量未有显著变化,表明14.2 kD磷酸化的增强可能不是MAPK作用的结果。

3讨论

LPS能激活Mφ非受体型Src家族的TPK，后者以TPK→Raf→MAPK kinase→MAPK途径激活MAPK^［9］。MAPK的激活是其酶蛋白特定部位Tyr/Thr同时双重磷酸化导致的，但