摘要目的：探讨诱导人T细胞对猪抗原免疫耐受的状况。方法：通过建立人幼稚淋巴细胞与猪抗原递呈细胞混合培养模型，以淋巴细胞增殖实验及毒性实验、DNA分析、淋巴细胞表面标志检测等手段，观测了幼稚淋巴细胞分化、发育过程中对异种负调细胞疫苗初次接触与再次刺激的免疫应答状况的变化。结果：发现在体外，异种负调细胞疫苗能诱导人幼稚及成熟T细胞产生免疫耐受；辅助信号系统耐受在诱导过程中起着至关重要的作用。结论：提示在该系统中免疫耐受发生的机理是克隆排除与免疫无应答。

中国图书分类号R392.11

An experimental study on the in vitro induced immune tolerance of human

T cell to porcine antigen-presenting cells

LI Yan,WU Jun,CHEN Wei-Pei et al.

Institute of Burn Injury and Department of Applied Surgical Anatomy and Operation Surgery,The 3rd Military Medical University,Chongqing 400038

AbstractObjective:To investigate the possibility and mechanism of the tolerance of human T cell to porcine antigen-presenting cells,the present study tried to prepare a kind of down-regulating cell vaccine(DRCV) and establish an in vitro novel model of immune tolerance,i.e.,mixed immature lymphocyte-porcine APC reaction.Methods:Based on this model,the lymphocyte proliferation,cytotoxicity,apoptosis,immunohistochemistry and FACS were used for analyze of immature T-cell differentiation,the reaction of immature T-cell to both primary and secondary APC stimulation,and the apoptosis of reactive T cells.Results：The results showed that:DRCV presented a very low level of CD86 expression,but the normal level of MHC-Ⅱ;DRCV could induce the antigen-specific immune tolerance of both immature and mature T cells and the underlying mechanism of this kind of immune tolerance was of anergy and clonal deletion occurred during the secondary encounter between human memorial T cells and the xeno-APC.Conclusion:According to the above data, propose that the expression of TCR on immature T-cell is regulated by antigens;the co-stimulatory signals play critical roles in the induction of both immature and matrue T-cell immune tolerance;and clonal deletion and unresponsiveness is responsible for the antigen-specific immune tolerance.

Key wordsImmune toleranceT cellsXeno-transplantation

近30年来，随着器官移植学的发展，特别是80年代以来，以CSA为代表的新型免疫抑制剂的出现以及多种单克隆抗体的广泛应用，有效地阻止和治疗了排斥综合症，使得同种异体移植的成功率显著提高^［1］，人类移植器官的来源缺乏成为主要矛盾^［2］。由于猪的器官与人体器官大小形态相近，来源广泛，器官移植学上属于非协调性容易型移植，因此，选择以猪为供体来源具有极为现实的意义和广泛的应用前景^［3］。但是，人对猪的排斥反应更难以控制，由于同时免疫抑制剂降低和破坏了机体正常的免疫防御体系，这些都是器官移植学急待解决的问题。免疫耐受是指针对内源性和外源性抗原特异性的长期免疫反应状态。所以，只有宿主产生对供体的免疫耐受，才是供体移植物长期存活于宿主体内而不被排斥的根本保证^［4］。免疫耐受的诱导及其机理的研究是涉及基础理论及临床应用的重大课题。然而，目前所有的诱导方案均因各自的缺陷尚不能用于临床，免疫耐受的机理也远未阐明。本实验拟通过创建新的体外免疫耐受模型和制备异种负调细胞疫苗，采用淋巴细胞定向培养、淋巴细胞增殖实验、淋巴细胞毒性实验、DNA 分析、流式细胞仪检测细胞表面抗原和受体表达、免疫组化等手段，研究幼稚淋巴细胞在此模型中的分化与发育，发育过程中的淋巴细胞对异种负调细胞疫苗初次接触与再次刺激的免疫应答及其细胞凋亡等，探讨负调细胞疫苗诱导幼稚及成熟T细胞免疫耐受的可能性及相应的细胞和分子生物学机制，为寻找符合临床应用条件的有效诱导策略与方法提供理论和实践依据。

1材料与方法

1.1材料来源及分组本实验分别采用健康人清除成熟T细胞的骨髓细胞作为耐受模型中受者免疫系统以及健康人外周血单个核细胞作为外周耐受实验中受者免疫系统。健康成年食用家猪外周血抗原递呈细胞-单核细胞作为异种供体刺激原(以下简称抗原细胞)；将用1%多聚甲醛处理后的猪单核细胞作为耐受原-诱导疫苗(以下简称疫苗细胞-vaccine)^［5］。Balb/c 小白鼠外周血的单核细胞作为第3种族来源的抗原。

模型分为3组：对照组(Control)，疫苗诱导组(Group induced by vaccine,GIV)，抗原刺激组(Group stimulated by porcine APC,GSA)。每组重复3个样本。各组经细胞培养15 d左右，检测相关指标。

相关试剂来源：IMDM培养基：美国Gibco公司。胎牛血清：美国Hylone公司。rhIL-3：第三军医大学防原教研室，10×10⁴ U/支。CD2、CD3、CD4、CD8鼠抗人单克隆抗体：北京中山生物技术有限公司产品。新鲜AB型人血清：西南医院血库提供。免疫组化试剂(ABC)：北京中山生物技术有限公司产品。D5637、FITC-CD2、FITC-CD3单克隆抗体：华西医科大学附属一院提供。P-I染液：华西医科大学附属一院提供，50 mg/ml。³H-TdR：中国同位素公司北京原子能研究所，1 mCi/m1。CytoTox96,Non-radioactive Assay 试剂盒：美国Promega公司。CD86(B_7-2)单抗：美国Serotec公司。

1.2实验模型的建立

1.2.1完全培养液的制备IMDM，10%胎牛血清，谷氨酰胺，2-巯基乙醇，硫酸庆大霉素，rhIL-3。

1.2.2人幼稚骨髓单个核细胞的制备取健康人骨髓单个核细胞，加入CD3单克隆抗体和人补体，清除成熟T细胞后备用。

1.2.3人外周血单个核细胞的制备取健康人外周血分离得到单个核细胞备用。

1.2.4供体抗原及疫苗的制备取新鲜猪外周血单核细胞作为异种供体细胞抗原。将一部分用1%多聚甲醛固定处理作为诱导疫苗。

1.2.5骨髓细胞耐受诱导模型的建立制备的供体抗原及疫苗按1：15比例分别加入1.2.2中备用的骨髓细胞中，组成抗原刺激组(GSA)和疫苗诱导组(GIV)；加1 ml IMDM培养液于上述1.2.2中备用的骨髓细胞中组成对照组。于37℃ 5%CO₂培养液中培养13～15 d，进行指标观察。

1.2.6鼠抗原靶细胞的制备Balb/c小鼠外周血单核细胞，2 000 rad⁶⁰Co照射，调定浓度1×10⁵ cells/ml，备用。

1.3观测指标

1.3.1观测骨髓细胞以及外周血细胞在本培养模型中的生长状况。

1.3.2用流式细胞仪检测骨髓耐受诱导模型各组T细胞在生长过程中部分表面标志、CD2、CD3表面标志。

1.3.3观测骨髓耐受诱导模型各组细胞生长过程中细胞周期与细胞凋亡。

1.3.4用混合淋巴细胞增殖试验单向法(MLR)检测骨髓耐受诱导模型中各组接受再刺激的淋巴细胞增殖状况。

1.3.5用细胞毒性试验检测骨髓耐受诱导模型中各组接受再刺激后的淋巴细胞的杀伤功能。

1.3.6观测1%多聚甲醛固定后的单核细胞表面标志CD86(B_7-2)及MHC Ⅱ表达。

1.4数据处理均以±s表示，采用Microsoft Excel 97统计程序及本校SPMR程序包进行单因素、双因素方差分析。

2结果

2.1有关骨髓诱导模型的数据

2.1.1各组骨髓细胞在此培养条件下的生长状况见表1。在本培养体系中，CD3骨髓细胞在生长的第1天至第5天活细胞数明显下降，以后其数量逐步回升。第11～13天，细胞生长趋于稳定，两者比较，P＞0.05，无显著差异。各实验组之间各个时相点的活细胞数基本一致，无显著差别(P＞0.05)。

2.1.2外周血单个核细胞在此完全培养条件下的生长状况见表2。在本培养体系中，第1～5 天活细胞数明显下降，P＜0.01，以后其数量进一步下降；5～9 d间比较，P＜0.05；11 d以后大多死亡。

2.2模型各组细胞生长过程中CD2、CD3的表达状况见表3。各组骨髓细胞培养当天，清除成熟T细胞，流式细胞仪检测结果显示CD2⁺、CD3⁺细胞几乎无表达。经20 d培养，对照组、疫苗诱导组分别与培养当天各组比较，P＜0.01，差异极显著，提示从幼稚淋巴细胞发育而来CD2⁺细胞有显著增加。对照组与疫苗组CD2表达的比较，P＞0.05，无显著差异。

2.3模型各组细胞生长过程中细胞周期与凋亡见<