摘要目的：在Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统中表达人FGF-9。方法：采用RT-PCR技术，自新鲜人脑胶质瘤组织获取人FGF-9全编码区cDNA，将其克隆入pCR^TMⅡ质粒及pYEX4T-1真核表达质粒，经DNA自动测序仪进行DNA序列测定。将人FGF-9 cDNA定向克隆入pFastBac质粒,进一步将其转座入Bacmid中，在昆虫细胞Sf9中进行表达，采用SDS-PAGE对表达产物进行分析。结果：在昆虫细胞表达系统中表达出人FGF-9重组蛋白。结论：人FGF-9在Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统中得到了表达。

中国图书分类号R392.11

Expression of human fibroblast growth factor-9 in Bacmid-baculovirus

expression system

LI Hui, WEI Gang，YU Yong-Li.

Department of Immunology, Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021

AbstractObjective: To express human fibroblast factor-9(hFGF-9). Methods: The full-length cDNA of hFGF-9 was isolated from human glioma by reverse transcription-PCR. The specific cDNA was cloned into pYEX4T-1 plasmid. The insert was confirmed by DNA sequencing , subcloned into pFastBac donor vector and transposed into Bacmid in DH10Bac. The recombinant Bacmid was used to transform Sf9 cells. The supernatant and cellular lysate were analyzed by using SDS-PAGE. Results: A specific protein in the cellular lysate of Sf9 containing hFGF-9 with MW 30 kD was found. Conclusion: hFGF-9 has been expressed in the Bacmid-baculovirus expression system.

Key wordsFibroblast growth factor-9ExpressionBaculovirusInsect cellsTransposon

杆状病毒-昆虫细胞表达系统是一种真核细胞表达系统。该系统有许多优点：可在进行多种蛋白质的转录后加工修饰，表达水平极高，可达细胞蛋白的50% ；可表达非常大的基因；可同时表达多个外源基因；表达的蛋白质根据其本身的特性在昆虫细胞内外分布。这一表达系统自问世以来，人们对其进行了多方面的改进，使其不断完善。Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统是一种新型杆状病毒-昆虫细胞表达系统。我们用这一系统进行了人FGF-9表达的尝试。

1材料与方法

1.1菌种和质粒pYEX4T-1购自 CLONTECH Lab-oratories, INC, pFastBac和 DH10Bac购自GIBCO/BRL, pCR^TM Ⅱ质粒购自Invitrogen,菌种DH5α、INVaF由本

室保存。

1.2酶和试剂Trizol试剂购自GIBCO/BRL,引物经由上海生工合成，TaqDNA聚合酶、纯化质粒DNA所用的试剂盒(Wizard)、DNA回收试剂盒购自Promega公司, 逆转录酶、RNase、T4连接酶及限制性核酸内切酶购自大连宝泰克公司，TC-100购自GIBCO/BRL,新鲜人脑胶质瘤组织来自吉林省肿瘤医院。

1.3PCR引物的设计及人FGF-9 cDNA片段的扩增根据已发表的人FGF-9 cDNA序列^［1］,我们设计了一对PCR引物,上游引物：5'ACAA GAATTC ATGGCT CCCTTA GGTGAA G3';下游引物：5'TCGC GTCGAC TCAACT TTGGCT TAGAAT ATC-3'。上游引物5'端带有EcoRⅠ酶切点，下游引物3'端带有SalⅠ酶切点。采用常规RT-PCR技术获取特异性cDNA。

1.4PCR产物的克隆及测序将PCR产物克隆入pCR^TM Ⅱ质粒，详细方法见文献［2］。经蓝白筛选、酶切鉴定获得阳性克隆。pCR^TM Ⅱ重组质粒及 pYEX4T-1真核表达质粒经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切后，将释放出的片段次级克隆入pYEX4T-1真核表达质粒。经酶切鉴定出阳性克隆后，经宝泰克公司自动测序仪进行DNA序列测定。

1.5重组Bacmid的制备将pYEX4T-1 载体上人FGF-9 cDNA片段以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点定向插入pFastBac供体质粒，在DH5α宿主菌内扩增，鉴定出阳性克隆后，将重组pFastBac供体质粒转入DH10Bac细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素及IPTG的培养板上挑选白色菌落，重新划板进行鉴定。然后取阳性的白色菌落培养，裂解，提取重组 Bacmid。0.5%琼脂糖凝胶电泳,23 V 12 h。

1.6人 FGF-9的表达在含有10%FCS的TC-100 培养液中培养Sf9细胞。将生长状态良好的细胞移至24孔板，每孔细胞数约为 2.3×10⁵个细胞。室温放置 10 min，待细胞贴壁后，吸去培养液。每孔加入 1 ml溶液B(25 mmol/L Hepes, pH7.1,125 mmol/L CaCl₂,140 mmol/L NaCl) 和重组Bacmid 5 μg ,同时以未重组Bacmid (5 μg)和单纯细胞培养为阴性对照。27℃培养4 h后，加入 1 ml含10%FCS的TC-100培养液，在27℃孵箱中培养。根据病毒感染Sf9细胞状况，72 h后收集上清及细胞。离心后，对上清及细胞沉淀按常规方法进行SDS-PAGE。

2结果

2.1人FGF-9 cDNA的获取及序列测定从人新鲜脑胶质瘤组织中以RT-PCR法获得特异性cDNA。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，长度约为647 bp(见图1)。将PCR产物克隆入pCR^TM Ⅱ质粒，然后将目的片段次级克隆入pYEX4T-1真核表达质粒。重组pYEX4T-1质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆(见图2)。DNA测序的结果表明，扩增的cDNA片段确为人FGF-9全编码区cDNA，编码208个氨基酸（见图3）。

图1琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物

Fig.1Analysis of hFGF-9 specific RT-PCR products by agarose gel electrophoresis

Note:lane 1:PCR marker;lane 2:hFGF-9 specific cDNA product

图2琼脂糖凝胶电泳分析重组pYEX4T-1质粒

Fig.2Electrophoretic analysis of recombinant plasmid

Note:lane 1:PCR marker;lane 2:PCR product of hFGF-9;lane 3:the pYEX4T-1～hFGF-9 plasmid digested with EcoR I and Sal I

图3人FGF-9 cDNA测序的部分结果

Fig.3Part of cDNA sequencing of hFGF-9

2.2人FGF-9在昆虫细胞（Sf9）中的表达将人FGF-9 cDNA片段以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点亚克隆至pFastBac供体质粒（重组质粒具有氨苄抗性），经双酶切及2％琼脂糖凝胶电泳鉴定出阳性克隆。用pFastBac供体质粒转染DH10Bac细胞（感受态细菌抗卡那霉素和四环素），提取重组Bacmid 。将提取物用0.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,取完整的Bacmid (＞135 kb)做PCR鉴定。未插入目的片段的pFastBac供体质粒转座后PCR产物长度是2 300 bp，重组Bacmid 的PCR产物长度为2 924 bp(见图4)。用转座成功的重组Bacmid 转染Sf9细胞，72 h后，收集上清为扩增重组的杆状病毒，用 100 μl收集的上清重新感染Sf9细胞（1×10⁶个），72 h后，收集上清。将上清做倍比稀释后再感染Sf9细胞，以确定杆状病毒滴度。用适量的病毒感染昆虫细胞，72 h后，取培养上清及细胞沉淀按常规方法进行SDS-PAGE。结果表明，重组杆状病毒感染的昆虫细胞表达1条对照细胞不表达的、分子量为30 kD左右的蛋白带。这与报道的人FGF-9的蛋白质分子量基本一致(见图5)。

图4重组Bacmid的鉴定

Fig.4Identification of recombinant Bacmid

Note:A.electrophoretic analysis of recombinant Bacmid;lane 1:λDNA/Hind Ⅲ marker;lane 2:the recombinant Bacmid;B. PCR verification of recombinant Bacmid;lane 1:PCR product;lane 2:λDNA/Hind Ⅲ marker

图5表达产物的SDS-PAGE分析

Fig.5The SDS-PAGE analysis of expressed proteins

Note:lane 1:protein markers;lane 2～4:the lysate of control;lane 5:the lysate of Sf9 cell containing recombinant Bacmid;lane 6:the supernatant of Sf9 cell containing recombinant Bacmid

3讨论

苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)是应用最为广泛的杆状病毒表达载体。AcNPV是环形双链DNA病毒，分子量为130 kb左右。具有感染性的病毒进入易感昆虫细胞6 h后开始复制。在感染早期<