摘要目的：探讨腺病毒介导的肿瘤抗原基因修饰的树突状细胞(DC)体内免疫后对抗原特异性抗肿瘤免疫反应的诱导作用。方法：以β-gal为模拟抗原，以转染有LacZ基因并稳定表达β-gal的淋巴瘤细胞E22为肿瘤细胞模型，用携带编码β-gal的LacZ基因的重组腺病毒载体(AdLacZ)转染小鼠骨髓DC，检测转染的效率及LacZ基因修饰DC刺激T细胞增殖的能力，观察皮下免疫LacZ基因修饰DC后小鼠引流区淋巴结细胞数量和组分的变化以及诱导产生CTL和抵抗E22细胞再攻击的能力。结果：LacZ基因修饰后24、48、72 h，均能检测到80％以上的DC表达β-gal，此基因修饰的DC可有效刺激同基因型小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应；将其皮下免疫小鼠1 w 后再接种E22细胞，小鼠的存活期较其他DC免疫小鼠显著延长，但对B16黑色素瘤细胞的攻击无免疫保护作用。此外，LacZ基因修饰的DC免疫小鼠的引流淋巴结细胞数量显著增加，且产生了针对E22的而非EL-4或B16的特异性CTL。结论：腺病毒介导的肿瘤抗原基因修饰的DC能有效诱导机体产生特异的抗肿瘤免疫反应。

中国图书分类号R392.1

Induction of specific antitumor immune responses by vaccination

with tumor antigen gene-modified dendritic cells

TANG Hua,CAO Xue-Tao,YU Yi-Zhi et al.

Department of Immunology,Second Military Medical University,Shanghai 200433

AbstractObjective:To investigate whether vaccination with antigen gene-modified dendritic cells(DC) could induce specific antitumor immunity,using β-gal as a model tumor antigen.Methods:DC were generated from bone marrow in the presence of mGM-CSF(3.3 ng/ml) and mIL-4(1 ng/ml)，and then,transfected with a recombinant adenovirus encoding LacZ gene(AdLacZ). The efficacy of LacZ gene transfection and T cell stimulating activity of DC were detected.The number and cell subsets of draining lymph nodes,CTL activity of the mice s.c vaccinated with DC were observed.Results:Visual X-gal staining showed that more than 80％ DCs were transfected with LacZ gene.Vaccination with those genetically modified DC could increase the cell number of draining lymph node and induce β-gal specific CTL most significantly. After vaccination with the β-gal gene-modified DC,the survival time of the mice challenged with wild-type E22 cells (a clone of EL-4 lymphoma expressing β-gal)1 week later was prolonged more potently than that of the mice vaccinated with other DCs.No proteckive effect was observed in the mice challenged with B16 melanoma cells.Conclusion:The results demonstrated that specific antitumor immune responses cound be induced efficiently by vaccination with tumor antigen gene-modified DC.

Key wordsDendritic cellAntigenGene modificationAdenovirusCTLVaccine

树突状细胞(Dendritic cells,DC)是目前所知的是功能最强的、也是唯一能激活初始性T细胞(Nat-ive T cell) 的专职抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell,APC)，在免疫应答中处于中心地位。近年来体外大量扩增DC的方法日益成熟，使DC用于肿瘤治疗受到重视^［1，2］。Porgador 等用MHC I类分子限制的肿瘤抗原多肽体外致敏的DC免疫小鼠，不但诱导产生了特异性CTL，同时也使小鼠获得了抵抗肿瘤再攻击的能力^［3，4］。本室曾用GM-CSF基因修饰的DC经肿瘤抗原体外致敏后或与肿瘤细胞融合后免疫小鼠，使小鼠产生了更强的特异性抗肿瘤免疫反应^［5，6］。若将肿瘤抗原基因转染至DC并使之持续表达，有可能更有效地发挥DC的抗原提呈作用，而诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫应答。Chen等曾以LacZ基因作为模拟的抗原基因、以其表达产物β-半乳糖苷酶(β-gal)作为模拟的抗原并以转染了LacZ基因、能稳定表达β-gal的胸腺淋巴瘤细胞EL-4的亚克隆E22为模型研究抗原特异性抗肿瘤免疫反应^［7］，鉴于将β-gal为模拟抗原的实验体系稳定、简便、明确，因此，我们利用E22为肿瘤细胞模型，通过携带有编码LacZ基因的重组腺病毒载体(AdLacZ)的介导，探讨腺病毒介导的抗原基因修饰的DC能否诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫反应，为以DC为基础的肿瘤主动性免疫基因治疗提供实验依据。

1材料与方法

1.1动物和细胞株C57BL/6小鼠(H-2^b)，6～8周龄，雌性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。胸腺淋巴瘤细胞株EL-4(为C57BL/6小鼠来源)以及稳定表达β-gal的IL-4细胞亚克隆细胞株E22(来自转移有编码LacZ基因的EL-4，用含400 μg/ml G418的RPMI 1640培养基选择培养，X-gal染色率100%)均由美国克利夫兰医学中心陈卫博士惠赠；B16为C57BL/6小鼠来源的黑色素瘤细胞株，本室常规传代。

1.2主要试剂携带编码LacZ基因重组腺病毒AdLacZ)及E1区缺陷的腺病毒Ad5，由日本癌症研究所基金会Hamada博士惠赠；大鼠抗小鼠单抗CD3-PE、CD4-PE、CD8-PE、NK1.1-PE和FITC标记的羊抗大鼠荧光二抗均购自PharMingen公司，抗小鼠CD4、CD8、B220/CD45R、Ia、FcR、和33D1的单抗为本室从常规培养的杂交瘤上清中纯化所得，mGM-CSF和mIL-4均购自Sigma公司，同位素³H-TdR、Na₂⁵¹CrO₄均自Amersham公司。

1.3骨髓树突状细胞的培养参考Inaba的方法略作修改^［8］，取C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞，Tris-NH₄Cl溶去红细胞，PBS洗2次后，用大鼠抗小鼠CD4、CD8、B220/CD45R、Ia和FcR混合单抗液重悬，4℃孵育45 min，洗涤后加入低毒兔补体(1∶10稀释)，37℃介溶45 min，PBS洗2次后，用含重组mGM-CSF（3.3 ng/ml）和mIL-4(1 ng/ml)的RPMI 1640完全培养基于6孔培养板上培养(1×10⁶ cell/ml)。第3天，轻轻晃动培养板，吸弃悬浮细胞，补入新鲜的含同样浓度mGM-CSF和mIL-4的完全培养基，第6天收集非粘附细胞和疏松粘附的增殖性树突状细胞聚集体，于培养瓶中继续培养2 d，收集悬浮的细胞即为DC。

1.4DC的基因修饰及修饰后的DC对小鼠的免疫收集第8天的DC，调整至1×10⁶ ml^-1于6孔培养板上，以MOI值50加入AdLacZ或Ad5，37℃，1 h后补加正常培养液，24 h后，收集并洗涤2次。X-gal染色以明确转染效率及转染后24、48和72 h的AdLacZ表达情况。以3.5×10⁵/只给小鼠右后肢股外侧皮下免疫。

1.5DC刺激同基因型小鼠T细胞增殖能力的检测经上述基因修饰的DC，加入丝裂霉素C，终浓度为25 μg/ml，于34℃孵箱中孵育45 min，洗2次，作为刺激细胞。取经灭活E22细胞免疫1 w后的C57BL/6小鼠的脾脏，制成单细胞悬液，Tris-NH₄Cl溶去红细胞，洗2次后注入尼龙毛柱，置37℃孵育1 h，预热的PBS(37℃)冲洗出非粘附细胞，作为T细胞即反应细胞。将DC与T细胞按1∶100、1∶330、1∶1 000的比例在96孔培养板上培养72 h，于结束培养前16 h加入³H-TdR(1 μCi/孔)，常规收集细胞，置WALLAC1409液闪仪上检测，计算cpm值。

1.6DC免疫的小鼠引流区淋巴结细胞数量的变化及组分的FACS分析DC免疫1 w后，取小鼠右后腹股沟浅淋巴结，制备成单细胞悬液，细胞总计数，并用大鼠抗小鼠CD3-PE、CD4-PE、CD8-PE、NK1.1-PE、33D1单抗于4℃标记30 min后洗2次，对于需间接标记的33D1样本管，加入FITC-羊抗大鼠单抗，4℃标记30 min后洗2次，流式细胞仪(FACS Calibur,BD)检测细胞表型，分析淋巴细胞组分。

1.7CTL的体外诱导及杀伤活性的检测DC免疫7 d后取脾脏T细胞(5×10⁶ ml^-1)与灭活的E22细胞按20∶1的比例，在含IL-2 100U/ml的RPMI 1640完全培养基中培养，第5天收集活细胞作为效应细胞，Na₂⁵¹CrO₄标记1 h的E22或EL-4或B16细胞作为靶细胞，以100∶1、50∶1、25∶1不同的效靶比，用⁵¹Cr 4 h释放法检测CTL的活性，同时设最大释放组和自然释放组。以下式计算杀伤率：

1.8DC免疫后的保护作用于DC免疫1 w后，皮下接种E22细胞(2×10⁷/只)或B16(1×10⁵/只)，每组10只，观察小鼠的存活期。

2结果

2.1腺病毒介导的LacZ基因修饰DC的效率X-gal染色表明，腺病毒介导的LacZ基因修饰后24、48、72 h，80%以上DC细胞蓝染；而对照组即没有用LacZ转染的DC，不见细胞着色，表明腺病毒能有效介导模拟抗原β-gal基因转染至DC。

2.2LacZ基因修饰DC的抗原提呈能力如图1所示，LacZ基因修饰DC刺激同基因型鼠脾脏T细胞的增殖水平明显高于未用LacZ基因修饰的DC和对照腺病毒Ad5感染的DC(P＜0.05)。