摘要目的：探讨ICAM-1相关肽抑制角朊细胞将超抗原TSST-1递呈给T淋巴细胞。方法：应用鼠抗人CD54单克隆抗体筛选噬菌体随机十五肽库，经4轮筛选后，挑取20个克隆进行测序，利用含保守序列的阳性克隆噬菌体对角朊细胞递呈超抗原TSST-1给T细胞进行阻断试验。结果：得到保守序列为ITRSFQSSMEPGPPG，所筛选的阳性噬菌体克隆与野生型噬菌体相比具有明显的阻断效应(P＜0.01)。结论：ICAM-1相关小分子肽可望降低超抗原介导的皮肤炎症反应。

中国图书号分类号Q7R392.12

Inhibiting the co-stimulating effect of keratinocyte using ICAM-1 related peptide

ZHANG Ming,YANG Gui-Zhen.

Department of Immunology,Norman Bethune University of

Medical Sciences,Changchun 130021

AbstractObjective:To explore the inhibiting effect of ICAM-1 related sequences peptide on keratinocytes which present superantigen TSST-1 to T cells.Methods:Used mouse anti-human CD54 McAb to screen phage display 15-mer peptide random library.After 4 round selections chose 20 clones at random and analyzed the DNA sequences.Used the phage contained conservative sequences to block that keratinocytes present superantigen TSST-1 to T cells.Results:The conservative amino acid sequence is ITRSFQSSMEPGPPG.The blocking effect of positive colonal phage is significantly stronger compared with that of wild type phage(P＜0.01).Conclusion:ICAM-1 related small peptide could reduce skin inflammation mediated by superantigens.

Key wordsPhage display SuperantigenIntercellular adhesion molecule-1ToxicShock syndrome toxin-1Keratinocytes

细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是一种表达于多种细胞表面的跨膜糖蛋白，是最早发现的免疫球蛋白的超家族粘附分子之一。通过与其相应的配体整合素家族成员之一的LFA-1相互作用，在介导细胞的信号转导与活化、炎症反应及创伤愈合等一系列重要的生理和病理过程中发挥重要作用^［1］。正常情况下，人表皮角朊细胞(keratinocytes，KC)不表达ICAM-1，但在许多炎症性皮肤病病损处，KC可表达ICAM-1^［2］，体外试验表明，经IFN-γ处理培养中的人类KC可表达MHC Ⅱ类分子及ICAM-1^［3，4］；免疫组化研究表明表达ICAM-1r KCgn LFA-1阳性T细胞可同时集中于某一部位，表明ICAM-1在皮肤炎症过程中发挥着重要作用。因此，寻找一种ICAM-1的拮抗物来阻断ICAM-1-LFA-1介导的细胞粘附将有助于缓解炎症反应的发生。本文应用噬菌体展示技术(Phage display)钓取ICAM-1的相关序列并对其在KC辅助超抗原介导的T细胞增殖中的封闭效应进行了研究。

1材料与方法

1.1材料K91菌株，野生型噬菌体Fusel，测序引物均为美国密苏里大学Smiths博士惠赠；T7 DNA聚合酶测序试剂盒购自Promega公司，³²P-dATP购自北京亚辉公司；鼠抗入CD54、HLA-DR单抗购自北京中山生物技术有限公司；TSST-1、人基因工程重组IFN-γ购自军事医学科学院。

1.2噬菌体十五肽库的筛选^［5］链亲合素包被聚苯乙烯培养皿^［5］，4℃过夜，2% BSA封闭37℃ 1 h，TBS洗3遍，加入生物素化抗ICAM-1抗体4℃过夜，次日洗去未结合的噬菌体，测滴度用于下一轮筛选。共进行4轮筛选，回收率稳定。

1.3阳性克隆噬菌体单链的制备取4轮筛选物测滴度，随机挑取40个单克隆经扩增、PEG沉淀回收噬菌体，200 μl TBS溶解测滴度，留100 μl备用，另100 μl经酚：氯仿/异戍醇抽提、乙醇沉淀后经琼脂糖电泳证实。

1.4阳性噬菌体克隆DNA序列分析用Sanger双脱氧末端终止法对所提单链进行测序，测序方法参照Promega公司T7DNA聚合酶测序试剂盒说明书。电压2 200 V，预电泳30～40 min，正式电泳3～4 h。

1.5含有保守序列的阳性克隆噬菌体的阻断活性检测

1.5.1经尼龙毛柱法分离T淋巴细胞流式细胞仪检测T细胞纯度为94.2%，台盼蓝排除试验，细胞活力在98%以上。调细胞浓度1×10⁶/ml。

1.5.2角朊细胞培养参照文献［6］取培养1 w的角朊细胞经IFN-γ(500 U/ml)处理48 h，取少量细胞置Cytospin制片，应用免疫细胞化学染色法检测ICAM-1及HLA-DR，剩余细胞调成浓度1×10⁶/ml备用。

1.5.3经扩增的单克隆噬菌体及野生型噬菌体Fusel经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌测滴度为1×10⁷/ml备用。

1.5.4T细胞增殖阻断试验于96孔细胞培养板内加入1×10⁵/孔 IFN-γ处理的KC，加丝裂霉素(终浓度25 μg/ml)37℃水浴30 min后弃上清，实验组加入含保守序列的阳性克隆噬菌体，对照组加入空载体Fuse-1，共设10⁶、10⁵、10⁴、10³、0共5个梯度，最后各孔均加含TSST-1(终浓度10 μg/ml)的T淋巴细胞悬液100 μl(含1×10⁵细胞)37℃ 5%CO₂培养48 h后，用MTT法检测。

2结果

2.1筛选及单链提取经4轮筛选回收率稳定在10^-5～10^-6，所提单链DNA分子量位于9 000 bp(图1)。

图1阳性克隆单链DNA琼脂糖电泳

Fig.1Electrophoretic analysis of positive phageclonal ssDNA

2.2测序结果共得到12个可读序列，保守序列为5’-ATTACTCGCAGTTTTGAGTCTAGTATGGAGCCTGGTCCGCCTGGT-3’(图2),经推断其氨基酸序列为Ile-Thr-Arg-Ser-Phe-Glu-Ser-Ser-Met-Glu-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly即ITRSFQSSMEPGPPG。

图2阳性克隆的保守核苷酸序列

Fig.2Conservative nucleotide sequence of positive phage clone

2.3KC表达HLA-DR及ICAM-1免疫细胞化学染色结果表明IFN-γ处理的KC可表达HLA-DR分子及ICAM-1阳性反应细胞膜呈棕褐色物质沉着，而IFN-γ未处理的角朊细胞不着色(图3、图4)。

图3免疫组织化学染色检测KC表达HLA-DR(A)和ICAM-1(B)

Fig.3Observation of HlA-DR(A) or ICAM-1(B)expressed on the surface of KC;by immunohistochemistry staining

Note:a.IFN-γ-untreated KC；b.IFN-γ-treated KC

图4阳性克隆对KC递呈超抗原TSST-1给T细胞的阻断作用

Fig.4The blocking effect of positive phage clone on kerationocytes which present superantigen TSST-1 to T cells

Note:①compared with wild type phage(P＜0.01)

2.4阻断试验结果表明所筛选的克隆噬菌体在10⁶及10⁵滴度的情况下对KC辅佐超抗原活化T细胞增殖具有显著的阻断作用，而应用野生型噬菌体无此作用(P＜0.01)，说明所筛选阳性克隆噬菌体所表达的短肽在此发挥了作用，尽管本实验未观察到阳性克隆噬菌体的最大封闭效应所具备的滴度，但在所设的滴度范围内，其封闭作用与噬菌体的滴度呈正比(图4)。

3讨论

噬菌体展现技术(Phage display techniques， PDT)是由美国Smith博士于1985年首次提出并建立和发展起来的利用丝状噬菌体在体外表达外源基因的一项新技术，其要点是，以经过改建的噬菌体为载体，将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因P Ⅲ或P Ⅷ区，从而使表达的外源短肽或蛋白质表达在噬菌体表面，并使表达产物保持良好的空间构象并发挥良好的生物学活性，从噬菌体肽库中筛选目的短肽是研究蛋白质分子之间相互作用的一个有效工具^［5，7］。根据上述原理我们利用鼠抗人ICAM-1 McAb从随机十五肽库中筛选出可与抗ICAM-1 McAb结合的噬菌体，从理论上讲，该噬菌体表面表达的随机小肽(十五肽)即为ICAM-序列中的某一段或与其高度同源的相关序列。近年来研究表明，在超抗原介导的炎症性皮肤