摘要目的：通过优化设计利用大肠杆菌表达人白细胞介素4(IL-4)并提高其表达量。方法：根据原核翻译起始序列的局部二级结构自由能，设计了AUG上下游序列，并在人IL-4基因下游插入部分大肠杆菌LacZ序列以提高mRNA的稳定性。结果：成功地构建了人IL-4的高效表达克隆，命名为pLCM182-hIL4。SDS-PAGE分析显示所表达的重组IL-4蛋白质占细菌总蛋白的30%。目的基因下游没有插入LacZ序列所构建的表达克隆pCZH-hIL4在大肠杆菌中的表达量则占细菌总蛋白的20%左右。结论：所设计的优化表达方法对人IL-4基因的表达是成功的，在细胞因子的工程化表达中，优化设计对基因的表达量至关重要。

中国图书分类号R392.11

The optimizing expression of human interleukin 4 in E.coli

HUANG Xin,ZHAO Zhong-Liang,CAO Xue-Tao.

Department of Immunology,Second Military Medical University,Shanghai 200433

AbstractObjective:Gene expression of cytokines in E.coli has become a routine method to get recombinant cytokines.The human interleukin 4(hIL-4) was expressed in E.coli at low levels that had not exceeded 10%.It is possible to evaluate its expression level by local sequence design.Methods:In the present study,the region around the start codon was designed based upon free energy of RBS local second structure,and partial sequence of E.coli LacZ gene was inserted in the downstream region to improve the statility of the expressing gene.Thus the constructed expression vector with hIL-4 was very efficient and was terminated pLCM182-hIL4.Results:The expressed hIL-4 was up to 30% of total bacterial protein,and the expression level decreased to 20% if the hIL-4 gene was not followed with that partial LacZ gene.Conclusion:The data showed that the optimized methods adopted was successful in hIL-4 expression and indicated optimizing design would be effective in improving gene expression levels of cytokines.

Key wordsHuman interleukin 4Gene expressionE.coliOptimizing expression

人白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)是一重要的免疫活性调节分子，主要由Th2细胞产生，在T细胞、B细胞、巨噬细胞的增殖分化及功能调控方面起重要的作用^［1-3］。近年来发现IL-4在树突状细胞扩增培养中至关重要^［4］，而树突状细胞作为一种体内最强的抗原提呈细胞在抗肿瘤、抗感染免疫中具有不可忽视的作用，随着对其相关机制的进一步认识，IL-4可能会显示出更多的研究和应用价值。利用大肠杆菌来表达细胞因子目前已成为常规手段，对于人IL-4的表达也已有报道，但表达量较低^［5，6］(约5%～10%的水平)。本研究根据前人研究基因表达的经验，利用计算机辅助设计起始密码子(AUG)上下游的序列，根据该局部二级结构的自由能来选择对表达影响最小的局部序列，以提高基因表达时的翻译水平。同时，在目的基因的下游插入部分大肠杆菌LacZ序列试图以此来提高mRNA的稳定性，从而进一步提高基因的表达量。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1质粒和菌株克隆、测序、表达一体化载体pLCM182由本室构建^［7］；大肠杆菌DH5α购自Gibco。

1.1.2主要实验试剂淋巴细胞分离液(ρ=1.077)购自Sigma；异硫氰酸胍购自Fluka；反转录采用Gibco Superscript Preamplification试剂盒；各种工具酶均为Promega公司产品；人IL-4标准品购自Gibco(5×10⁶ U/mg)。

1.1.3主要实验材料正常成人外周血来自作者本身。PCR引物：上游ATAATGCACAAGTGCGATATCACCTTA；下游TTGGATCCTCAGCTCGAACACTTTGAATA由Cybersyn公司合成。

1.2方法

1.2.1PCR引物的设计与载体的选择利用计算机辅助设计起始密码子(ATG)上下游序列，根据局部二级结构的自由能来选择对表达影响较小的局部序列，选择从SD到ATG的局部序列为AATTA。本室构建的克隆、测序、表达一体化载体pLCM182在其多克隆位点后携带部分大肠杆菌的LacZ序列，该序列具有一定的稳定mRNA的作用。

1.2.2人IL-4基因的克隆正常成人外周血经梯度离心(梯度离心液ρ=1.077)后，收集交界层的PBMC，以Hank's液洗3遍后，以1×10⁶在含20 μg/ml PHA的PRMI1640培养基中培养，置于37℃，5%CO₂中培养48 h后收集细胞，以异硫氰酸胍一步抽提法得总RNA后反转录。PCR参数为95℃ 20 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环。特异扩增条带根据人IL-4基因中所包含的酶切点初步鉴定。

1.2.3人IL-4基因在载体中的定向克隆克隆、测序、表达一体化载体由本室构建，将pLCM182用EcoR Ⅱ BamH I 酶切，制备成一平一粘的载体片段；同时PCR产物也经BamH I酶切制备成一平一粘的基因片段。两个片段在T4 DNA 连接酶的催化下于16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态菌。挑取阳性转化子作小量制备及酶切鉴定。能被Pst I单酶切下一约260 bp片段的克隆为阳性克隆。

1.2.4人IL-4在大肠杆菌中的诱导表达取鉴定为阳性的克隆菌在32℃下培养至平台期，以1%转接至SOB、LB、2×YT中，在32℃振摇至OD值约为0.4时，迅速转入42℃中继续振摇4 h，收集细菌以SDS-PAGE分析人IL-4的表达。

1.2.5表达的IL-4生物学活性的检测挑选一表达克隆在2×YT中诱导表达后收集菌体，重悬在约1/5体积的裂解缓冲液中(50 mmol/L Tris-HCl pH8.0;1 mmol/L EDTA;100 mmol/L NaCl,1 mmol/L PMSF)超声粉碎后收集碎片，用含4 mol/L尿素的裂解缓冲液洗3遍，溶于8 mol/L的尿素中，在4℃存放过夜，以PBS梯度透析后测定生物学活性。生物学活性测定用MTT法，反应性细胞株为TF1，人IL-4的标准品为Gibco产品。

2结果

2.1人IL-4基因的PCR扩增及酶切鉴定以PHA刺激的正常成人PBMC的mRNA为模板，经PCR扩增出一约400 bp的条带，该条带经Pst I酶切后产生两个大小分别为150和250 bp的片段，初步确定其为人IL-4基因(图1)。

图1人IL-4基因片段的PCR扩增结果

Fig.1Identification of PCR amplified hIL-4 gene fragment

Note:lane1,DNA marker;lane2,PCR amplified hIL-4 gene fragment;lane3,the amplified fragment digested with Pst I

2.2人IL-4基因的定向克隆、测序及表达PCR片段经DNA聚合酶补平后BamH I酶切，制备成基因片段。载体pLCM182则以EcoR V和BamH I双酶切后制备成载体片段。在T4 DNA连接酶作用下连接载体片段和基因片段。转化感受态大肠杆菌后挑选阳性转化子，经Pst I酶切后能产生一360 bp左右片段的克隆为阳性克隆。用ABI 377自动测序仪直接以M13mp18测序引物测序，结果克隆的人IL-4基因序列与发表序列完全吻合，将其命名为pLCM-hIL4。携带pLCM-hIL4的大肠杆菌经热诱导后在SDS-PAGE上显示一分子量为14 kD左右高表达蛋白带(图2)，该带经激光灰度扫描测定占细菌总蛋白的30%以上，该基因在SOB、2×YT和LB中均可高表达。

图2人IL-4的表达结果

Fig.2Expression of hIL-4

Note:lane 1～3，pLCM-hIL4 expressed in LB,2×YT and SOC,respectively; lane 4,protein MW marker

2.3人IL-4表达产物的生物学活性测定将包涵体初步纯化后所获得的蛋白用人IL-4反应性细胞株TF1以MTT法测定其生物学活性。其粗制品即显示出明显的生物学活性，比活性约为5×10⁴ U/mg蛋白，经离子交换和HPLC进一步纯化的蛋白比活性可为10⁶ U/mg，并成功地应用于人树突状细胞的培养。

3讨论

利用原核表达系统表达人IL-4早有报道，van Kimmenade A 等^［5］利用Trp启动子，Batchikova N V等利用tac启动子^［9］和李晨等利用P_RP_L启动子^［6］均有成功表达，所获得的人IL-4在非糖基化状态下亦具有生物学活性；尤其是李晨所构建的表达载体通过温度诱导法表达人IL-4，相对Trp启动子系统和tac启动子系统不仅能更好地促进目的基因的表达，还避免了表达产物后期处理过程中去除诱生剂等问题^［6］。但是，他们所采用的表达系统表达量较低，仅为5%～10%。

外源基因在原核表达系统中<