摘要目的：建立一个在大鼠心肌细胞表达人白细胞介素10(Human Interleukin 10, hIL-10)的重组逆转录病毒载体基因转移系统，为下一步的研究工作做准备。方法：将构建的表达人白细胞介素10的逆转录病毒重组体pLX(hIL-10)SN经PA317细胞包装，G418筛选，NIH3T3细胞进行病毒滴度测定，选滴度最高的克隆(6×10⁵CFU／ml)作为感染大鼠心肌细胞的感染细胞；用重组逆转录病毒感染大鼠心肌细胞，应用聚合酶链反应(PCR)及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染大鼠心肌细胞DNA及mRNA，应用ELISA测定hIL-10在心肌细胞的表达。结果：外源性hIL-10基因已整合到心肌细胞染色体DNA并有效地转录和翻译，表达水平最高达1 755 ng／(10⁶cells*24 h)。结论：外源性hIL-10基因可以转移到大鼠心肌细胞并稳定表达，为今后研究hIL-10的作用机制及在治疗疾病中的应用打下了基础。

中国图书分类号Q789

Expression of human interleukin 10 in rat cardiomyocytes by retroviral vector

LI Jin-Hua, CHEN Yong-Xiong, ZHANG Shi-Guang et al. Emergency Department, the First Affiliated Hospital, Sun-yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080

AbstractObjective: To establish a model expressing human interleukin 10 in rat cardiomyocytes(Rat CMC) by retrovial vector for further study.Methods: PLX(hIL-10)SN was introduced into packaging cell PA317, then to select PA317 by G418,to determine retrovirus producer cells titre by NIH3T3 for identification of producer clones making high-titre virus. Exogenous gene hIL-10 was transferred into Rat CMC by the highest titre producer cells clone (6×10⁵CFU／ml). After gene transfer 72 h, DNA and RNA were prepared from transfected Rat CMC for the polymerase chain reaction (PCR) and the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Expression of hIL-10 in transfected Rat CMC was checked by ELISA. Results: Exogenous hIL-10 gene has been subcloned into retroviral vector pLXSN successfully, exogenous hIL-10 gene has been integrated into the chromosal DNA of the transfected Rat CMC. RT-PCR and ELISA showed that exogenous hIL-10 gene was expressed in the transfected Rat CMC after transfection 48 h and the highest expression level was 1 755 ng／(10⁶cells*24 h).Conclusion: Exogenous hIL-10 gene can be transferred into Rat CMC and be expressed stably. The retroviral vector PLX(hIL-10)SN shall lay foundation for researching hIL-10 mechanism and its application for curing heart diseases.

Key words Gene transferRetroviral vectorHuman interleukin 10 Rat cardiomyocytes

白细胞介素10是T辅助细胞产生的以抑制Th1细胞克隆的细胞因子合成为特点的多效免疫调节因子。它具有抑制Th1细胞亚群细胞因子γIFN，IL-2,TNF-α，GM-CSF，LT等的合成；还具有抑制单核细胞中细胞因子如IL-1α，TNF-α，GM-CSF等合成^［1］；抑制巨噬细胞产生活性氧的中间体，抑制单核巨噬细胞依赖性NK细胞合成IFNγ和TNFα，抑制单核细胞HLA-II类抗原DR，DP，DQ的表达^［2］；抑制B₇，细胞粘附分子ICAM-1的表达^［3］。动物实验显示IL-10能抑制感染性休克小鼠的TNF-alpha和IL-1的高表达，降低死亡率^［4］；用IL-10处理的鼠郎罕氏细胞诱导了T细胞的无应答^［5］；以上这些特性表明IL-10具有重要的抗炎及免疫抑制作用，用于治疗免疫介导的炎症性疾病和用于抑制排斥反应具有广阔的应用前景。本实验建立一个在大鼠心肌细胞表达人白细胞介素10的重组逆转录病毒载体基因转移系统，为今后研究hIL-10的作用机制及在治疗疾病中的应用打下了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒，菌株和细胞大鼠表达人白细胞介素10的逆转录病毒重组体pLX(hIL-10)SN由本室构建^［6］；空白载体pLXSN，PA317，NIH3T3：军事医学科学院；Wistar大鼠：中山医科大学实验动物中心。

1.1.2主要酶和试剂RT-PCRkit：Promega；PCRkit：华美公司；DOTAP：Boehringer Marmnnheim；G418，DMEM／F12：GIBCO；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所，hIL-10 ELISA kit：深圳晶美公司。

1.2方法

1.2.1重组逆转录病毒的包装和重组病毒感染滴度测定将重组质粒pLX(hIL-10)SN和空白质粒pLXSN用DOTAP法导入逆转录病毒包装细胞PA317，培养72 h后，换含400 μg／ml G418的10%新生牛血清进行筛选；待抗G418抗性克隆形成后冻存于液氮中备用。将抗性克隆从液氮取出复苏，待细胞达70%～80%左右汇合时，收集其上清液，以10²～10⁴的倍数做系列稀释后，分别感染NIH3T3细胞(感染液中加Polybrene 4 μg／ml)，感染3 h后换液，继续培养72 h后用含800 μg／ml G418的培养基培养14 d。以抗性克隆上清液的稀释倍数乘以存活的抗G418的细胞克隆数为重组病毒感染滴度。单位为CFU／ml(集落形成单位／毫升)。

1.2.2大鼠心肌细胞的转染按文献［7］的方法培养Wistar大鼠心肌细胞。待细胞达60%～80%左右汇合时，分别加入上述抗G418抗性克隆pLX(hIL-10)SN和pLXSN上清(感染液中加Polybrene 4 μg／ml)，3 h后换为10%新生牛血清DMEM／F12进行培养；72 h时换为含800 μg／ml G418的选择性培养基培养；3 d后取细胞分别提取DNA和RNA。

1.2.3目的基因hIL-10在大鼠心肌细胞表达的检测

1.2.3.1目的基因hIL-10转移至大鼠心肌细胞的检测取上述转染的大鼠心肌细胞，PBS离心洗涤3次，按文献［8］的方法提取DNA作PCR，以一对引物

图1转染大鼠心肌细胞 DNA的PCR检测

Fig.1PCR detection of transfected rat cardiomyocytes DNA

Note:Lane 1.PCR product of Rat CMC DNA (transfected with pLXSN vector)；Lane 2.PCR product of Rat CMC DNA (transfected with pLX(IL-10)SN vector):679 bp；Lane 3.PCR marker

［引物A(pLXSN 1 511～1 530 bp 5′-GTCAAGCCCTTTGTACACCC-3′)，引物C(hIL-10 cDNA 546～525 bp 5′-CCTGATGTCTCAGTTTCGTATC-3′］检测目的基因在大鼠心肌细胞的整合。PCR：Denaturation 93℃×1 min，Annealing 50℃×1 min，extension 72℃×2 min,35 cycles, final extension 72℃×5 min(见图1)。

1.2.3.2目的基因hIL-10在大鼠心肌细胞转录的检测按文献［8］的方法提取总RNA，以引物B(hIL-10 cDNA 129～150 bp)，5′-TCTCCGAGATGCCTTCAGCAGA-3′)，引物C(见上)作RT-PCR，检测目的基因hIL-10在大鼠心肌细胞的转录。以一对引物(Sense：21～40：5′-CATAGACAAGATGGTGAAGG-3′，Anti-sense：590～517：5′-TCCACAGTCTTCTGAGTGGC-3′)扩增大鼠看家基因GAPDH的mRNA为阳性内参照(Sense 21～40 bp，5′-CATAGACAAGATGGTGAAGG-3′，Anti-sense 590～571 bp，5′-TCCACAGTCTTCTG AGTGGC-3′，570 bp)。反转录后PCR方法同上(见图2)。

1.2.3.3目的基因hIL-10在大鼠心肌细胞的表达按照ELISA kit提供的方法检测目的基因hIL-10在大鼠心肌细胞的表达。

图2转染大鼠心肌细胞RNA的RT-PCR检测

Fig.2RT-PCR detection of transfected rat cardiomyocytcs mRNA

Note:Lane 1.Internal control:RT-PCR product of Rat GAPDH mRNA:570 bp；Lane 2.RT-PCR product of Rat CMC mRNA (transfected with pLXSN vector)；Lane 3.RT-PCR product of Rat CMC mRNA (transfected with pLX(IL-10)SN vector):418 bp；Lane 4.PCR marker

2结果

2.1重组逆转录病毒的包装及重组病毒滴度测定未转入pLX(hIL-10)SN或pLXSN的PA317细胞，经选择性培养后，在3至7 d内死亡，而转入pLX(hIL-10)SN或pLXSN的PA317细胞存活，形成抗性克隆。经NIH3T3测定，其最大感染滴度6×10⁵CFU。

2.2目的基因在转染大鼠心肌细胞的表达

2.2.1转染大鼠心肌细胞DNA的PCR检测转染pLX(hIL-10)SN大鼠心肌细胞提取DNA作PCR，扩增产物在1.5%琼脂糖电泳分析显示转染pLX(hIL-10)载体的有特异性扩增的pLXSN(1 511 bp)至hIL-10 cDNA(546 bp)的片段，为67