摘要目的：探讨重组毒素IL-6D₂₄-Linker-PE40融合蛋白及其接头设计的合理性。方法：应用核酸和蛋白质序列分析软件系统-GOLDKEY软件，对IL-6D₂₄-Linker-PE40重组毒素融合蛋白的柔性、抗原性、亲水性、表位等分子生物学特性进行计算机模拟预测，并做Western blot分析进行验证。结果：IL-6D₂₄-Linker-PE40分别保留了IL-6D₂₄和PE40的表位特征，没有新的抗原表位出现，而且柔性接头处具有极低的抗原性。Western blot分析结果表明融合蛋白能分别与IL-6和PEA的单克隆抗体发生特异结合，这说明融合蛋白保留了IL-6和PE40的空间结构特征。结论：预测结果有助于我们更好地从实验中认识蛋白质生物活性。

中国图书分类号R392.11

The prediction of the molecular biology characteristics of recombinant fusion toxin IL-6D₂₄-Linker-PE40

ZHENG Li-Yan, XI Yong-Zhi, KONG Fan-Hua et al. Department of Immunology, North Tai Ping Road Hospital , Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100039

AbstractObjective：To discover the designing reasonability of recombinant fusion toxin IL-6D₂₄-Linker-PE40.Methods：Using GlODKEY，the molecular biology characteristics of recombinant fusion toxin IL-6D₂₄-Linker-PE40, such as flexibility, antigenicity, Hopp&Woods hydrophilicity and epitope, were predicted by computer analysis. The results were confirmed by Western blot.Results：It is indicated that the recombinant fusion toxin IL-6D₂₄-Linker-PE40 which has correct domains of IL-6D₂₄ and PE40 , can react with both MoAbs of IL-6 and MoAbs of PE40 simultaneously. The linker has low epitope, low antigenicity and high flexibility.Conclusion：The results will helps us to study the biological activity of the recombinant fusion toxin IL-6D₂₄-Linker-PE40.

Key words Recombinant fusion toxin IL-6D₂₄-Linker-PE40Molecular constructureComputer analysis

利用细胞因子-受体来介导重组细胞因子-外毒素融合蛋白以达到选择性杀伤高表达相应细胞因子受体的白血病及其它肿瘤细胞，标志着肿瘤导向杀伤策略研究的最新进展之一^［1，2］。鉴于白血病细胞异常高表达IL-6/IL-6R系统，而正常造血细胞几乎不表达或微量表达这一事实，我们在克隆了新型毒素蛋白绿脓杆菌外毒素(PE40)及人IL-6基因的基础上，新近采用基因融合新策略又构建成功了重组毒素IL-6D₂₄-Linker-PE40并在大肠杆菌中高效表达,试图为白血病的导向治疗提供杀伤特异性更强、疗效更好、毒副作用更小的IL-6D₂₄-Linker-PE40融合蛋白。由于重组毒素IL-6D₂₄-Linker-PE40并非自然界所固有的天然蛋白, 而且国际上至今对如何能设计构建成功人们所期望的理想的重组细胞因子融合蛋白还缺乏具有指导性的理论^［2］，本研究所构建的IL-6D₂₄-Linker-PE40融合蛋白能否达到所预期的高度特异性和高杀伤性， 这是我们最为关注的首要问题。为此，我们利用计算机模拟了IL-6D₂₄-Linker-PE40的某些分子生物学特性，诸如柔性、抗原性、亲水性、等电点及表位，以预测融合蛋白及其接头设计的合理性。

1材料与方法

1.1融合蛋白分子生物学特性的计算机预测采用军事医学科学院吴加金教授设计的GOLDKEY软件^［3］。

1.2Westem blot分析采用BIORAD公司的 Western blot分析试剂盒。抗人IL-6单克隆抗体由军事医学科学院沈倍奋院士提供，抗PEA抗体购自Sigma公司。

2结果

目前，从氨基酸序列预测蛋白质二级结构的方法将近20余种，主要为两大类，一是统计方法，主要考虑短程相互作用，基于已知晶体结构的蛋白质分子，统计出各残基、二肽或三肽片段在有序结构中出现的频率，以此预测肽段形成二级结构的可能；另一类方法是基于残基的物理化学性质，基于主体化学的考虑作出预测，基本上考虑了长程相互作用。我们应用完善的C-F法对IL-6D₂₄-Linker-PE40的氨基酸序列进行了预测，它是统计分析了29个已知晶体结构的蛋白，得出各残基形成α螺旋、β结构和转折

图1IL-6D₂₄-Linker-PE40柔性的计算机分析

Fig.1Flexibility prediction of proteins IL-6D₂₄-Linker-PE40 by computer

图2IL-6D₂₄-Linker-PE40抗原性的计算机分析

Fig.2Antigenicity prediction of proteins IL-6D₂₄-Linker-PE40 by computer

的构象参数以及α螺旋和β结构边缘出现的频率，将残基按形成还是破坏α或β结构的趋势分为6类，总结出形成有序二级结构的判定规则和条件，预测成功率为70%。

2.1柔性分析从理论上讲，柔性区的存在有利于蛋白质两侧功能区的正确折叠，使接头两侧的多肽片断和氨基酸侧链能够自由运动，形成具有生物活性的空间结构。为了使IL-6D₂₄和PE40融合后IL-6D₂₄和PE40各自的空间结构不受影响，在二者之间加一个柔性的接头，构建了融合蛋白IL-6D₂₄-Linker-PE40，这有利于IL-6D₂₄与其受体的特异性结合，更好地起到导向的作用。IL-6D₂₄-Linker-PE40柔性的计算机分析见图1。从图中可以看出，IL-6D₂₄-Linker-PE40在第161～180氨基酸附近存在着高柔性区，

图3IL-6D₂₄-Linker-PE40亲水性的计算机分析

Fig.3Hopp&Woods hydrophilicity prediction of proteins IL-6D₂₄-Linker-PE40 by computer

图4IL-6D₂₄-Linker-PE40表位的计算机分析

Fig.4Epitope analysis of proteins IL-6D₂₄-Linker-PE40 by computer

这说明IL-6D₂₄和PE40由柔性肽连接，伸展性大，相互作用小，能自由运动，各自均可发挥原有的生物学效能。

2.2抗原性分析融合蛋白两分子间的接头区不应具有抗原性，接头序列的加入应使其两侧多肽原有的抗原性保持不变，不应产生新的抗原性，稳定的

抗原性在临床应用中有重要的意义，IL-6D₂₄-Linker-PE40的抗原性计算机分析见图2。从图中可以看出，IL-6D₂₄-Linker-PE40分别与IL-6D₂₄和PE40相比，

没有产生新的抗原性，IL-6D₂₄-Linker-PE40在第161～180氨基酸的柔性接头处具有极低的抗原性，这为该融合蛋白的临床应用提供了一定的安全保证。

2.3亲水性分析蛋白质分子表面带电的亲水性氨基酸富集的部位构成局部亲水性强的区域，成为蛋白质分子的一种表面特征。从图3中可以看出，IL-6D₂₄-Linker-PE40与IL-6D₂₄和PE40相比，分别保留了IL-6D₂₄和PE40的亲水性区域，没有新的亲水表位产生，在IL-6D₂₄-Linker-PE40的第161～180氨基酸的柔性接头处呈中性，从等电点的预测中也可以看出（图略），柔性接头对等电点没有影响，IL-6D₂₄-PE40和IL-6D₂₄-Linker-PE40等电点均为5.15。

2.4表位分析表位是蛋白质分子的一种表面特征，位于那些充分暴露于溶剂或带电的亲水性氨基酸富集的部位，因此，对蛋白质的氨基酸序列中局部亲水性、序列中特定氨基酸的出现、主链的柔性等参数进行综合分析就可预测出序列局部亲水性强的区域，即表位区（图4）。从图中可以看出，IL-6D₂₄-Linker-PE40分别保留了IL-6D₂₄和PE40的表位特征，没有新的抗原表位出现。在第161～180氨基酸的柔性接头处表位量化指数低，表位特征差，说明IL-6D₂₄和PE40相互影响少，融合蛋白没有增加新的表位区。

2.5Western blot分析为了验证IL-6D₂₄-Linker-PE40是否分别具有IL-6D₂₄和PE40的抗原结构特征，对其进行了Western blot分析，结果表明，IL-6D₂₄-Linker-PE40能分别与IL