中国图书分类号R593.22

摘要目的：探讨类风湿关节炎（RA）患者体内是否存在抗Ⅹ型胶原B细胞反应。方法：以EL-4 OU^r BU^r/rIL-2/PMA作为刺激系统，通过酶联斑点技术检测抗Ⅹ型胶原免疫球蛋白分泌B细胞(anti-HCⅩ ISC)频率。结果：28例RA患者滑膜中11例出现 anti-HCⅩ ISC，而对照组骨性关节炎（OA）患者滑膜液中则未检测到anti-HCⅩ ISC。RA患者外周血及滑膜液CD19⁺及CD20⁺细胞百分率于刺激前后无明显变化，但CD5⁺B细胞百分率却明显增加, 外周血刺激前后分别为17.0±6.0,27.0±9.0, 滑膜液分别为8.0±3.2，16.0±6.0。结论：(1) RA患者体内存在抗Ⅹ型胶原B细胞反应,(2) CD4⁺ EL-4 OU^r BU^r/rIL-2/PMA是激活CD5⁺自身抗体产生B细胞的有效方法。

Detection and specificity analysis of B cell response to human collagen type Ⅹ in peripheral blood and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis

WANG Jiang-Bin, WANG Yu-Shan, ZHANG Xiao-Nan et al.

Department of Internal Medicine, The Third Hospital, Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130031

AbstractObjective:To detect the frequencies of B cell reaction to human collagen type Ⅹ (HCⅩ) in synovial fluid and peripheral blood in patients with rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA).Methods:The enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay was used for enumerating anti-HCⅩ immunoglobulin secreting cells (anti-HCⅩ ISC) after highly efficient polyclonal B cell stimulation with the thymoma cells line (clone OU^r BU^r) in conjunction with PMA and recombinant human IL-2.Results:A low level, but significantly of human collagen Ⅹ specific B cell reaction was found in SFMC of RA patients after stimulation with EL-4 thymoma cells together with PMA and rIL-2, however, this polyclonal activation was inefficiency in SFMC of OA patients. Similar ratios were found for cells that expressed CD19 or CD20 in both RA and OA patients after stimulation of PBMC and SFMC with EL-4/rIL-2/PMA, however, the number of CD5⁺ B cell was increased in both RA synovial fluid and peripheral blood. Specificity analysis demonstrated that B cell reaction with HCⅩ in SFMC of RA patients was strongly inhibited by anti-HCⅩ antibody but not by isotype matched anti-HCII antibody in both ELISA and ELISPOT assays.Conclusion:(1)antibody against type Ⅹ collagen in RA patients have pathogenic potential, however, this collagen Ⅹ specific B cell response only can be found in a very sensitive assay and a very sufficient stimulation. (2) CD4⁺EL-4 OU^r BU^r/rIL-2/PMA is efficient for activation of CD5⁺ autoantibody producing cells.

Key wordsRheumatoid arthritis Collagen type Ⅹ ELISPOT assay

类风湿关节炎(RA) 是国际范围内的常见病，病因尚不完全清楚，但自从人们发现人体对Ⅱ 型胶原的免疫反应是RA发病机理中的重要因素以来，本病在国内外引起研究者们的极大重视，而且进展相当迅速。

软骨细胞合成的胶原类型是不同软骨细胞不同分化阶段的特殊标志。软骨前体细胞和再分化软骨细胞合成Ⅰ、Ⅲ 型胶原，具有功能活性的透明软骨细胞合成Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅵ型胶原， 肥大软骨细胞已经被明确证实合成Ⅹ型胶原^［1］。以往人们研究比较多的是 RA 患者抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型胶原免疫反应，但也有人先后从RA患者血清及滑膜液中检测到抗Ⅸ、Ⅺ型微量胶原抗体^［2］,不过Ⅹ型微量胶原是否和Ⅸ、Ⅺ型胶原一样具有免疫原性，是否参与RA 的免疫病理损伤过程还是目前尚不清楚的问题。

本项工作是在我们预先已经观察了RA患者外周血及滑膜液Ⅱ型胶原反应B细胞频率的基础上^［3，4］，把最初由Zubler报道的一个多克隆B细胞刺激系统和由Sedgwick报道的从单细胞水平检测抗体分泌细胞技术结合起来^［5，6］，分析了RA患者外周血及滑膜液Ⅹ型胶原特异性B细胞免疫反应, 并与骨性关节炎 (OA) 患者进行了比较。

1材料与方法

1.1检测对象RA患者28例，男7例，女21例,年龄45～69岁，平均54岁,病程7个月～20年,平均5.1年。取标本当时15例患者正在服用强的松，所有患者在取关节液前3个月均未接受过关节腔内激素治疗。全部患者类风湿因子阳性并有局部关节严重损伤的CT或X线改变。骨关节炎患者15 例，其中男6例,女9例，年龄48～74岁，平均52岁，病程5个月～7年，平均3.9年。6例患者在取关节液当时正在服用非激素类抗风湿药，全部患者也均有关节局部严重损伤的CT或X线改变。

1.2试剂和细胞克隆EL-4胸腺细胞克隆(OU^r BU^r,RH Zuber教授,Geneva 瑞士),PMA(Sigma,Deisenhofen,德国),rIL-2(Eurocetus Amsterdam,荷兰),PWM(Gibco Eggenstein,德国),抗CD19、CD20、CD5抗体(Dianova Hamberg,德国),重组人Ⅹ型胶原(HCⅩ) 及抗Ⅱ型、Ⅹ型胶原抗体(anti-HCⅡ/anti-HCⅩ)均由von der Mark K教授提供(Erlangen,德国)。

1.3抗体分泌细胞的产生Ficoll-Hypaque 梯度离心分离外周血及滑膜液单个核细胞(PBMC及SFMC)，调整细胞浓度2.5×10⁵ml^-1，然后以照射后的EL-4 OU^r BU^r细胞(2.5×10⁵ml^-1)、PMA(3 ng/ml)、rIL-2(50 U/ml)进行刺激,6 d后收集细胞通过ELISPOT技术检测（anti-HCⅩ ISC）频率，部分试验于6 d后收集细胞培养上清，通过ELISA检测上清中抗体浓度。

1.4酶联斑点(ELISPOT）试验用HCⅩ包板，置4℃过夜，1%BSA封板后将刺激后的PBMC或SFMC加入培养板，37℃ 16 h后洗细胞，加入碱性磷酸酶标记抗人Ig、IgM或IgG抗体，37℃ 2 h后洗板，加入含琼脂的底物溶液（AMP缓冲的BCIP，pH10.25），12 h 后ELISPOT计数仪下通过计数蓝色斑点而计数anti-HCⅩ ISC。

1.5CD19、CD20、CD15 细胞表型分析采用间接荧光染色技术用抗CD19、CD20抗体分别染色外周血及滑膜液单个核细胞，用抗CD5抗体染色外周血及滑膜液B淋巴细胞,通过流式细胞仪分析CD19、CD20或CD5表达状况。

2结果

2.1不同刺激状态下外周血及滑膜液anti-HCⅩ ISC频率分析图1表明，当联合应用EL-4/rIL-2/PMA作为刺激原时，在RA患者滑膜液中引起一个较显著的Ⅹ型胶原特异性B细胞反应；而单独应用anti-HIg或PWM仅引起一个极低水平的B细胞反应。无论应用任何刺激原在外周血都未能引起一个可检测到的Ⅹ型胶原特异性B细胞反应。以同样方法刺激OA患者外周血及滑膜液，亦未检测到anti-HCⅩ ISC，图略。

图1不同刺激状态下RA患者外周血及滑膜液anti-HCⅩ ISC频率分析

Fig.1Frequencies of anti-HCⅩ ISC in PBMC and SFMC of RA patients

Anti-HCⅩ ISC产生的动力学分析结果表明在EL-4/rIL-2/PMA刺激状态下, 滑膜液中HCⅩ特异性IgG 或IgM 分泌细胞频率在5～6 d达到高峰(图略)，因此，在本研究中anti-HCⅩ ISC频率在刺激后第6天左右被检测。

2.2Anti-HCⅩ ISC 特异性分析应用ELISA及ELISPOT 技术分别证明滑膜液中Ⅹ型胶原特异性B细胞反应可以被反应系统中存在的anti-HCⅩ 所抑制，其抑制率达90%。对照组Ⅱ型胶原B 细胞反应则未被其抑制，图略。

2.3RA及OA患者滑膜液anti-HCⅩ ISC频率比较图2显示了不同个体滑膜液HCⅩ特异性IgG、IgM分泌细胞水平。结果表明部分RA患者anti-HCⅩ ISC水平明显增高，而全部OA患者SFMC经EL-4/rIL-2/PMA刺激后，均未显示明显的HCⅩ特异性B细胞反应。

图2RA及OA患者不同个体滑膜液anti-HCⅩ igG/IgM分泌细胞频率分析

Fig.2Individual levels of anti-HCⅩ ISC in SFMC of RA and OA patients

2.4RA患者外周血及滑膜液CD19⁺、CD20⁺及CD5⁺B细胞分析RA及OA患者外周血及滑膜液单个核细胞中CD19⁺及CD20⁺细胞百分率在EL-4/rIL-2/PMA刺激前后均无明显变化，但RA患者外周血及滑膜液B淋巴细胞中C