摘要目的：建立人树突状细胞(DC)的cDNA文库，通过大规模随机测序克隆免疫新分子。方法：来源于正常人外周血的单核细胞，体外经GM-CSF和IL-4培养，扩增出高纯度的DC，抽提纯化mRNA，转录成cDNA，定向插入pSPORT2.0载体，建立人DC的cDNA质粒文库；用ABI377全自动测序仪对该文库进行随机测序，将得到的EST在Sun-E450服务器中与EMBL及Swissprot数据库进行同源性比较，筛选出代表未知基因EST，然后在GCG软件中进行分析，对重要的未知EST克隆其全长cDNA。结果：所扩增的DC经流式细胞仪分析高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7、CDla和CD83等表面标志，能强烈刺激同种异体T淋巴细胞的体外增殖反应；建立的DC cDNA文库92%以上克隆有平均1.6 kb大小的插入片段；从所测的12 000余条EST中筛选出代表未知基因的3 000余条，克隆到109条全长新基因，包括属于细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和粘附分子等家族的免疫新分子，部分全长基因已在Genebank中登录。结论：成功建立了人DC的cDNA基因文库及其大规模随机测序体系，并克隆到免疫分子。

Establishment of large scale sequencing system for the cDNA library of

human dendritic cells

ZHANG Wei-Ping, CAO Xue-Tao, WAN Tao et al.

Department of Immunology, Second Military Medical University, Shanghai 200433

AbstractObjective： To construct cDNA plasmid library of human dendritic cells (DC) and establish large-scale sequencing system for new molecule identification.Methods:The peripheral blood monocytes from normal adults were cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 to generate highly purified human DC.DC were characterized by FACS analysis and MLR, and subjected to RNA extraction and poly(A)⁺RNA purification. The cDNA library was constructed by inserting the transcripted cDNA from human DC into pSPORT2.0 vector and identified by restrictive cleavage. The random clones from human DC library were picked for large scale sequencing by ABI377 automated sequencers to create our database of expressed sequence tags (ESTs), which were analyzed and processed by bioinformatic tools.Results:Monocyte-derived DC express high levels of CDla, CD83, MHC-Ⅰ, MHC-Ⅱ, CD40 and B7-1, and stimulate the proliferation of allogeneic T cells potently. More than 92% random clones from DC cDNA library have inserts averaging 1.6 kb. Among 12 000 currently available ESTs, 4.3% was identified to be functionally immune-related, and 25% represented unknown genes. Up to now, 109 full length cDNA were successfully identified, including some novel immune molecules such as cytokines, cytokine receptors, chemokines and adherent molecules,the immune functions of which are under further investigation.Conclusion:The system for large scale sequencing of human DC cDNA library was successfully established and demonstrated as efficient approach to new molecule identification.

Key wordsDendritic cells cDNA library Large scale sequencing Immune molecules Gene cloning

中国图书分类号R392.2

人类基因组计划(Human Genomic Projects, HGP)是生命科学领域的一项跨世纪工程，目的在于获得人类的全部基因组信息，揭示人类生命的奥秘及疾病的发生发展规律，最终探索出战胜疾病的方法。随着分子生物学和计算机技术、生物信息学的发展，大规模测序已成为揭示细胞基因表达谱和发现新分子的有效手段^［1，2］。树突状细胞(Dendritic cells, DC)是一类重要的专职抗原提呈细胞(APC)，来源于髓系和淋巴系，可能存在不同的细胞亚群，不同来源及不同亚群的DC在机体免疫应答中可能发挥不同的作用。近年来，树突状细胞的分化发育、抗原加工提呈机理及其在肿瘤、感染、自身免疫性疾病和移植排斥中的作用已经成为免疫学的前沿领域和研究热点^［3，4］。为深入认识DC的生物学功能，阐明其生物学作用的分子机理，我们在以往DC研究工作的基础之上^［5-8］，建立了人DC cDNA基因文库的大规模随机测序体系，以期从DC中寻找和发现具有我国自己知识产权的免疫新分子。

1材料与方法

1.1主要试剂rhGM-CSF、rhIL-4和人淋巴细胞分离液(Histopaque-1077)购自Sigma公司，FITC荧光标记的抗人HLA-A，B，C、HLA-DR、CD1a、CD40、CD14和B7-1单克隆抗体购自PharMingen公司，PE荧光标记的抗人CD83单抗购自Immunotech公司，cDNA质粒文库构建试剂盒购自Gibco公司，生物素亲和素磁珠mRNA纯化试剂盒(Boehringer), BigDye terminator四色荧光测序试剂盒购自Perkin-Elmer公司。

1.2主要设备及软件PCR9600、ABI377 DNA全自动测序仪及其数据采集软件Data Collection和分析软件Sequencing Analysis 3.0(Perkin-Elmer)、Sun-E450服务器及其操作系统Solaris2.6(Sun)，BLAST分析采用Wu-BLAST2.0软件(用Sun公司的Sunpro C语文编译)，所用核酸和蛋白数据库分别为EMBL(55.0，56.0，57.0)和Swissprot(36.0)，基因及蛋白分析软件为Wisconsin Package 10.0 (GCG)和Autostrider 1.2。

1.3人树突状细胞(DC)的培养扩增取正常成人外周血，经人淋巴细胞分离(Histopaque-1077)密度梯度离心分离单个核细胞，经无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS洗两次后悬于RPMI1640完全培养基，置37℃、5%CO₂培养2 h，弃上清，用预热的培养基洗去非贴壁细胞，然后加入含rhGM-CSF 100 ng/ml、rhIL-4 500 U/ml、10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，收集培养第7天的悬浮细胞即为DC^［8］，进行DC表型和功能鉴定，用于文库构建。

1.4人DC细胞表型的FACS检测5×10⁵细胞悬于FACS标记液PBA(100 μl/管)中，加入100 μl荧光标记抗体(0.5 μg)，于4℃孵育30 min，PBA洗两遍后悬于PBA中，用流式细胞仪FACScalibar及其分析软件CELLQuest检测分析。

1.5同种异体T淋巴细胞增殖反应分离正常人外周血单个核细胞，置37℃培养2 h后去除贴壁细胞，非贴壁细胞用5%人AB型血清的RPMI1640完全培养液悬浮，过尼龙毛柱(37℃孵育1 h)，制备的T淋巴细胞加入96孔板(每孔2×10⁵)。DC经丝裂霉素(25 μg/ml)于37℃处理1 h后，悬于含10%人AB血清的完全培养基，按不同剂量(每孔1×10³～1×10⁵)加入96孔板中与同种异体T淋巴细胞混合，每组设3个复孔，终体积为200 μl。置37℃、5%CO₂培养96 h，于结束前16 h加入³H-TdR(0.5 μCi/孔)，收集细胞，β计数仪检测cpm值。

1.6mRNA的抽提及人DC质粒文库的构建用Trizol(Gibco)提取DC(2×10⁷)细胞总RNA，用生物素标记的Oligo-dT和亲和素标记的磁珠(Boehringer)纯化PolyA⁺RNA。取4 μg PolyA⁺RNA，以NotI-OligodT为引物，在Superscript Ⅱ反转录酶的作用下合成cDNA第一链，第二链合成后经T4 DNA聚合酶补平，连接上SalⅠ适配子、经NotI酶切，用Sepharose 400分离柱去除500 bp以下小片段，然后将产物定向克隆至pSPORT2.0载体的Sa1I/NotI位点；连接反应产物经乙醇沉淀后溶于水，经电穿孔转化大肠杆菌DH10B。原始文库经半固体培养基培养扩增后置-70℃保存。随机挑取菌落，小量制备质粒DNA，用SalI/NotI酶切鉴定重组子插入cDNA片段的大小。

1.7人DC文库的大规模随机测序随机挑取DC文库的单个菌落，接种于96孔细菌培养板(Qiagen)，37℃振荡培养过夜，离心收集菌体制备模板，对克隆的5′端进行大规模测序筛选；根据Sanger双脱氧链终止法原理、用BigDye Terminator测序反应试剂盒在PCR 9600扩增仪(Perkin-Elmer)上进行测序反应，反应产物经纯化后溶于甲酰胺-EDTA/蓝色右旋糖苷；在ABI377全自动测序仪上行5%聚丙烯酰胺凝胶(36 cm)电泳(51℃，7 h)，用Data Collection软件采集原始胶图数据，经Sequencing Analysis 3.0读出碱基序列。

1.8数据分析原始的碱基序列经自行编制的软件去除载体序列及模糊序列后得到相应克隆的EST(Expressed sequence tag)序列，经以太网传至Sun-E450服务器中进行分析，分析流程见图1。首先将EST添加入我们自己的DC数据库(DCDB)，通过与已有的非冗余数据库(NRDB)的BLASTN比较，筛选到非冗余EST，进一步与EMBL数据库进行BLASTN分析，将与已知基因同源超过95%、同源片段长度超过100 bp的序列归为已知基因，同源性较低或同源片段小于100 bp的归为未知基因。非冗余EST根据分类存入NRDB数据库；未知基因的EST进一步用BLASTX分析其可能的编码蛋白，用GCG软件包对可能的编码蛋白进行基序(motif)搜寻、功能结构域分析以及蛋白质二级结构及相关理化性质的预测。对非全长克隆，根据分析结果确定是否克隆其全长cDNA。