摘要目的：跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)易在某些蛋白酶的作用下转换为分泌型TNF-α(S-TNF-α)。拟用基因突变技术获得稳定表达的、不能转换成S-TNF的TM-TNF突变体(TM-TNFm)。方法：应用RT-PCR技术，从人外周血单核细胞中扩增出编码TM-TNF-α的全长cDNA序列并构建pBSK-TNF-α重组体。以此为模板，借助改进的“一次重组PCR”定位突变技术，造成TM-TNF转换为S-TNF酶切位点的缺失，获得TM-TNF突变重组体(TM-TNFm)。结果：将TM-TNFm cDNA片段克隆至表达载体pGEM-3Zf，利用体外转录翻译系统表达出具有生物学活性的跨膜突变型TNF-α蛋白。经Western blot分析证实，用胶原酶不能将TM-TNF突变体酶解成为S-TNF。结论：提示所构建的TM-TNFm去除了可转换为S-TNF的酶解氨基酸序列，为进一步研究跨膜型TNF杀瘤作用奠定了基础。

中国图书分类号R392.11

Construction and in vitro translation of transmembrane tumor necrosis factor-α

mutant gene

ZENG Jin-Yang, LI Zhuo-Ya, GONG Fei-Li et al.

Department of Immunology,Tongji Medical University,Wuhan 430030

AbstractObjective：Transmembrane TNF-α (TM-TNF-α) can readily be converted by certain proteinase into secretary TNF-α(S-TNF-α). Therefore, in the present study, the authors attempt to make use of mutagenesis technique for constructing a kind of stable expressed TM-TNF mutant (TM-TNFm) which would not be cleaved into S-TNF.Methods: A full length of TM-TNF-α cDNA was amplified from the human monocytes by RT-PCR and cloned into plasmid pBSK to construct recombinant pBSK-TM-TNF. pBSK-TM-TNF-α mutant was then obtained by deletion of enzymatic site for conversion of TM-TNF into S-TNF-α with the site-directed mutagenic method of modified "Single-Step PCR".Results: The mutant was subcloned into expression plasmid pGM-3Zf and then in vitro transcribed and translated into protein which displayed its biological activities. As shown by Western blot, TM-TNF mutant could not be speciafically hydrolyzed into S-TNF by collagenase. Conclusion:These results suggested that TM-TNFm produced was indeed void of the amino acids sequence that could be enzymatically cleaved laying a foundation for the further study on the anti-tumor activity of TM-TNF.

Key wordsTransmembrane TNF-α(TM-TNF-α)Transmembrane TNF-α mutant (TM-TNFm-α)Site-directed mutagenesis by single-step PCRIn vitro translation

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以17 kD分泌型（S-TNF-α）和26 kD跨膜型（TM-TNF-α）二种形式存在^［1］。目前研究表明，TM-TNF主要是通过细胞-细胞间直接接触发挥局部生物学效应，其毒副作用较小，且可介导对S-TNF耐受细胞株的细胞毒作用^［2,3］，这就为肿瘤的生物学治疗提供了新途径。但是TM-TNF-α是S-TNF-α的前体，易在某些蛋白酶的作用下转换为S-TNF^［4］。为避免S-TNF的全身毒副作用,本研究用基因定点突变技术造成编码该酶切位点的核苷酸序列缺失，以获得稳定表达的、不能转换成S-TNF的TM-TNF突变体(TM-TNFm)。

1材料与方法

1.1质粒、菌株、酶及主要试剂质粒pbluescriptK(pBSK)和pGEM-3Zf及大肠杆菌E. coli TG1、JM109由本教研室收藏。AMV逆转录酶(美国GIBCO公司)；限制性内切酶(Hind Ⅲ, BamH I)、T4 DNA连接酶、体外转录翻译系统、非同位素体外翻译检测系统及犬胰腺微粒体(美国promega公司)；Tag DNA聚合酶(德国BNC公司)；m⁷ G(5′)ppp(5′)G(德国Boehringer Mannheim公司)。

1.2重组pBK-TM-TNF的构建按常规方法从人静脉血中分离单核细胞，LPS（100ng/ml）刺激3h后，提取细胞总RNA^［5］。以此为模板，利用TM-TNF专一性引物(5′端引物为-GCGGATCCATGAGCACTGAAAG-

CATGATCC,3′端引物为CCCAAGCTTCAGGGCAATG-

ATCCCAAAGTA，德国Essen大学提供), 进行RT-PCR反应，反应总体积50 μl。反应条件为：94℃变性1 min，60℃退火1 min， 72℃延伸1 min，共30次循环；PCR产物纯化分离后，经BamH I/Hind III双酶切，与载体pBSK/BamH I+Hind III连接,并转化至大肠杆菌TG1中。得到重组质粒pBSK-TM-TNF-α。

1.3一次重组PCR定位突变法（S-PCRmethod)以重组质粒pBSK-TM-TNF为模板(0.1 μg)，在缺失部位两侧设计一对引物，5′端引物为GTAGCCCATGTTGTAGCAAAC，3′端引物为TGCCTGGGCCAGAGGGTT-

GAT(由本校分子生物学教研室合成)，PCR反应成分同上。PCR扩增条件为：94℃ 1 min，64℃ 2 min，72℃ 4 min，共35个循环。PCR产物纯化回收^［6］后,用大片段Klenow酶室温处理1 h；酚/氯仿抽提后，用T4 DNA连接酶（20 U, 16℃孵育24 h）使线性DNA分子自身环化，再转化至大肠杆菌TG1，获得的克隆用TM-TNF特异性引物作PCR扩增，并与TM-TNF的PCR产物比较，初步筛选出突变重组体。

1.4核苷酸序列的测定采用PCR-双脱氧链终止法，在ABI 373a DNA测序仪上进行序列测定。

1.5体外表达重组质粒的构建将TM-TNFm cDNA片段克隆至表达载体pGEM-3Zf/Hind III，BamH I；转化大肠杆菌JM109，得到pGEM-3Zf-TM-TNFm重组质粒。

1.6重组质粒的体外转录和翻译按照体外转录系统试剂盒的实验指南进行操作，在T7 RNA聚合酶的作用下将质粒DNA体外转录成带帽mRNA。然后应用兔网织红细胞裂解物体外翻译试剂盒，以tRNAnscend^TM tRNA为体外翻译合成特异性蛋白产物的标记物，在犬胰腺微粒体存在的条件下体外合成TM-TNFm。同时体外翻译合成TM-TNF未突变体作为对照。

1.7Western blot分析取适当体外翻译产物进行15% SDS-PAGE凝胶电泳；然后采用半干电转移法将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维膜上；借助非同位素体外翻译检测系统，通过显色反应鉴定出体外翻译的特异性产物。

2结果

2.1TM-TNF和TM-TNFm 重组体的构建用TM-TNF引物对突变重组质粒作特异性PCR扩增，并与TM-TNF的PCR扩增产物进行比较，其电泳结果见图1a。第4,5泳道是从突变重组体中扩增出的条带，约在676～1 198 bp处，与第2,3泳道的TM-TNF扩增产物相比，分子量略小，这与TM-TNFm cDNA的理论值（666 bp)基本相符。突变重组体用BamH I和Hind III双酶切后，可得到一个约0.67 kb的cDNA插入片段（见图1b）。进一步对重组体pBSK-TM-TNF及pBSK-TM-TNFm进行核苷酸序列分析，结果证实，通过S-PCR突变技术获得的TM-TNFm被删除了编码分泌型TNF的Val⁺¹～Pro⁺¹²位的所有密码子，共36个碱基。

图1TM-TNF与TM-TNFm PCR扩增产物及pBSK-26 kD TNFm重组子的酶切电泳图谱

Fig.1Electrophoresis analysis of TM-TNF and TNF-TNFm PCR products as well as enclonuclease digested recombnant mutant

Note:a)1.PGEM DNA marker;2,3.PCR products of TM-TNF;4,5.PCR products of TM-TNFm.b)1.λDNA／Hind Ⅲ+Eco RI Marker;2.pBSK-26kD TNFm+Bam H I+Hind Ⅲof TM-TNFm

2.2在体外转录表达翻译系统中表达TM-TNFm蛋白用兔网织红细胞体外翻译系统，在犬胰腺微粒体膜存在的条件下，分别在体外翻译合成TM-TNF及TM-TNF突变体。经Western blot分析，结果如图2所示。可见，体外合成的TM-TNF分子量为26.0 kD，而体外合成的TM-TNFm分子量略小于TM-TNF；通过对靶细胞L929及HL60作胞毒活性检测，表明体外表达的TM-TNFm蛋白产物具有生物学活性（1 000 U/ml)。

图2体外翻译产物Western blot分析

Fig.2Western blot analysis of in vitro translation products

Note:1.protein marker ;2.TM-TNF protein;3.TM-TNFm protein;4.17.0 kD S-TNF protein

2.3体外合成的TM-TNF及其突变体的酶解分析将体外翻译产物26.0 kD TNF及其突变体分别用胶原酶和胰蛋白酶处理，再进行Western blot分析。结果如图3，胶原酶可将体外合成的26.0 kD TNF转变为17.0 kD蛋白分子；但对26.0 kD TNFm无降解作用(第3,6泳道)。以上两种体外翻译蛋白经胰蛋白酶作用后均被分解成约16.0和13.5 kD两个小片段(第4,7泳道)。

猜你喜欢

• 针刺研究在美获肯定——美国NIH召开针刺疗法听证会

  2022-07-30

• 第18届国际生物化学与分子生物学学术会议将于英国伯明翰

  2022-07-30

• 中华医学会产生新一届理事会，吴阶平任名誉会长，张文康

  2022-07-30

• 一九九九年第十一届全国爱牙日主题及口号

  2022-07-30

• ’99世界养生大会信息

  2022-07-30

• 中国红十字会全国会员代表大会闭幕

  2022-07-30