摘要目的：观察神经酰胺对HL-60及中性粒细胞(PMN)凋亡产生的影响,探讨其在粒细胞发生过程中可能的调节作用。方法：采用DNA凝胶电泳,流式细胞术,光镜及RT-PCR等技术对细胞进行凋亡鉴定及相关基因bcl-2, c-myc mRNA表达分析。结果：神经酰胺(C₂ -ceramide), 肿瘤坏死因子(TNFα)及长春新碱(Vincristine)均可不同程度地诱导HL-60及成熟PMN产生凋亡, CPK激活剂PMA, Diacylglycerol无诱凋作用, 并对TNFα,C₂-ceramide及Vincristine诱导的凋亡有不同程度的抑制；上述药物刺激后bcl-2, c-myc mRNA表达在HL-60细胞中呈明显下调趋势, c-myc mRNA表达在PMN中也呈轻度下调。结论：神经酰胺可作为HL-60、PMN胞内介质参与凋亡信号的传导，且与CPK途径及bcl-2，c-myc基因表达相关。

中国图书分类号R392.12

Induction of apoptosis by ceramide in human promyelocytic cells and its mechanism

XIN Hong, YAN Guang-Tao, HAO Xiu-Hua et al.

Laboratory of Biochemistry, Basic Medical Center, General Hospital of PLA, Beijing 100853

AbstractObjective： To determine the effects of ceramide on apoptosis and regulation in granulocytes differentiation processes.Methods： DNA fragmentation, FACS , light microscope and RT-PCR were employed to determine the apoptosis and bcl-2,c-myc mRNA levels of granulocytes.Results： C₂-ceramide, TNFα and Vincristine all resulted in a time and dose-dependent apoptosis of PMN and HL-60 cells.They also induced down-regulation of bcl-2,c-myc mRNA expressions in HL-60 cells and a light down-regulation of c-myc mRNA expression in PMN. A proper dose of phorbol ester (PMA) and diacylglycerol could not induce cell growth suppression but inhibite apoptosis induced by the drugs above.Conclusion： Ceramide was a mediator of apoptosis in PMN and HL-60 cell. The transduction of apoptotic signal was correlated with the CPK pathway,the down-regulation of bcl-2 and c-myc mRNA expression.

Key wordsApoptosisCeramidebcl-2c-myc gene

细胞凋亡(Apoptosis)是细胞生理性死亡过程,在维持机体内环境稳定,减少自身免疫及炎症反应中有重要作用。中性粒细胞(PMN)是炎症反应的重要标志, 在炎症的发生、发展和转归中起至关重要的作用。PMN的清除机制仍未明确,但近年来认为通过凋亡方式在膜完整状态下被巨噬细胞识别和清除^［1］,是维持机体正常数量PMN,进而限制细胞损伤,促进炎症吸收的重要机制。

神经酰胺,即N-脂酰鞘氨醇(Ceramide)是神经鞘磷脂(SM)主要的水解产物, 作为一个新的第二信使分子参与调节细胞的生长,分化,特别是在介导细胞凋亡中的意义已引起人们的关注^［2］。HL-60细胞是人早幼白血病细胞,但适当因子刺激(如PMA)可发生成熟性分化^［3］,且具有较高强度的自发生成氧的活性,使其具有一定的原始粒细胞特点,因此我们拟用HL-60细胞及成熟中性粒细胞为模型,观察加入外源神经酰胺及胞内神经酰胺诱导剂的情况下,对其凋亡产生的影响,探讨其在粒细胞发生过程中可能的调节作用,以新的角度认识炎症的发生和调控机制。

1材料与方法

1.1主要试剂和器材C₂-ceramide(N-acetyl sphingosine), 1,2-Diacylglycerol,佛波脂(PMA), 长春新碱(Vincristine)及碘化丙啶(PI)均购于Sigma公司; TNFα为邦定公司产品,AMV逆转录酶,DNA聚合酶为芬兰Finnzymes公司产品, bcl-2 cDNA克隆质粒pSBC2(阳性对照)由德国Dr.W.Dirks惠赠。流式细胞仪为美国B-D公司FACS Calibur，基因扩增仪为Biotechs公司HS-97型。

1.2人外周血PMA分离取健康献血者抗凝血, 按常规方法立即进行PMA分离。

1.3细胞培养1×10⁶ ml^-1 HL-60细胞及分离的人外周血PMA,基础培养条件为RPMI 1640培养液中含10%新生牛血清,青链霉素各100 U/ml,37℃含5% CO₂ 孵箱培养。

1.4细胞基因组DNA提取及电泳1×10⁶ ml^-1细胞按常规方法提取基因组DNA,电泳条件为1.8%琼脂糖凝胶,80 V电泳3 h, EB染色, 紫外透射下观察,拍照。

1.5细胞总RNA提取采用Chomozyrski异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法^［4］ 。简言之, 准确计数细胞, 按5×10⁵ ml^-1加入变性液(异硫氰酸胍4 mol/L, 柠檬酸钠25 mmol/L, Sarkosyl 0.5%, β-巯基乙醇0.1 mol/L pH7.0)水饱合酚, 氯仿/异戊醇49:1, NaAc 2 mol/L pH4.0, 冰浴, 离心, 异丙醇沉淀, 真空干燥, 加10 μl DEPC*H₂O溶解待用。

1.6半定量RT-PCR测定bcl-2, c-myc mRNA表达Oligod T18为引物, AMV作用下合成cDNA,反转录体系为20.0 μl, 含10×反转录缓冲液2.0 μl, Oligod T 18 1.0 μl(50 pmol), 4×dNTP 4.0 μl(2.5 mmol) RNasin 0.5 μl, RNA 5.0 μl, 逆转录酶4 U,42℃孵育60 min, 98℃ 3 min后, 取5.0 μl进行PCR。

分别合成bcl-2扩增引物 P1 5′GGACAACATCGCCCTGTG3′, P2 5′AGTCTTCAGAGAACAGCCA-

GGA3′, c-myc扩增引物P3 5′CAAGAGGCGAACACACAACGTCT3′, P4 5′AACTGTTCTCGTCGTTTCCGC-

AA3′,内参照β-action扩增引物P5 5′GCGGGAAATCGTGCGTGACATT3′；P6 5′GATGGAGTTGAGGTAGTTTCGTG3′^［5，6］,扩增片段分别为137,218,234 bp,50 μl扩增体系中含10×扩增缓冲液, 上下游引物各50 pmol, 4×dNTP(400 μmol)，耐热DNA聚合酶0.5 U。93℃ 变性3 min后,按93℃ 35 s、55℃ 50 s、72℃ 55 s 32个循环, 72℃延伸5～10 min。10 μl PCR产物以2%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.4 μg),100 V电泳20 min。紫外灯下鉴定结果。

1.7流式细胞仪测定细胞凋亡离心收集细胞(2×10⁶ ml^-1), 70%乙醇处理18 h, 离心弃上清, 少量PBS溶解细胞沉淀,加RNase(100 μg/ml), 37℃ 30 min,室温下PI(50 μg/ml)染色30 min, 流式细胞仪检测, 通过观察细胞周期变化及亚二倍体峰的出现来确认细胞凋亡及比例。

1.8细胞形态学检查细胞离心洗涤后, 常规制片。姬姆萨染色, 油镜观察。细胞膜完整但胞体缩小, 染色质浓缩成块或核碎裂, 判为凋亡细胞。

2结果

2.1体外培养PMA的自然凋亡人外周血PMA在体外常规培养, 随时间的延长,凋亡比例增加。流式细胞分析显示12 h后出现明显的GI峰前特有的亚二倍体峰(AP峰)，见图1。体外培养48 h DNA电泳出现明显的梯形降解。

图1体外培养PMN的流式细胞分析

Fig.1Confirmation of apoptotic changes in PMN with FACS caliburNote:A.0 h; B.6 h; C.12 h

2.2C₂ -ceramide, TNFα,Vincristine对PMN及HL-60细胞的凋亡诱导

2.2.1PMNC₂ -ceramide 5 μmol/ml,TNFα 200 ng/ml, Vincristine 1 μg/ml处理8 h后,流式细胞分析可见凋亡细胞比例高于自然凋亡率(对照组: 8.09%, C₂ -ceramide组: 12.82%, TNFα组: 17.90%, Vincristine组: 13.58%), DNA电泳可以发现降解明显增加。

2.2.2HL-60细胞用上述药物处理HL-60细胞24 h后, DNA电泳已可见明显梯形降解,以Vincristine 更为显著(图2)。光镜下也观察到明显凋亡改变。

图2不同药物处理HL-60细胞24 h的DNA电泳分析

Fig.2Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of HL-60 cells following treatment with ceramides for 24 h

Note:1. λDNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ; 2. 24 h normal control; 3. C₂-ceramide 50 μmol/ml; 4. C₂-ceramide 50 μmol/ml+PMA 400 pmol/ml; 5. C₂-ceramide 50 μmol/ml+diacylglycerol 200 μmol/ml; 6. TNFα 200 ng/ml; 7. TNFα 200 ng/ml+PMA 400 pmol/ml; 8.TNFα200 ng/ml+diacylglycerol 200 μmol/ml; 9. Vincristine 1 μmol/L; 10.Vincristine 1 μg/ml+PMA 400 pmol/ml; 11. Vincristine 1 μg/ml+ diacylglycerol 200 μmol/ml

2.3PCK激活剂Diacylglycerol及PMA对PMN及HL-60细胞凋亡的影响Diacylglycerol 100 μmol/ml , PMA 8 pmol/ml与PMN共同培养8,18,24,