摘要目的：研究人可溶性IL-6R(hsIL-6R)的空间构效关系，为小分子拮抗剂设计提供理论依据。方法：首先利用PCR技术扩增天然人sIL-6R基因片段，然后将第280位His残基突变成Ile。天然基因和突变体基因分别转染COS7细胞，经ELISA和Western blot检测证实转染细胞上清中的表达产物，并利用Binding assay ELISA和生物学功能分析法检测表达产物与IL-6的结合能力以及它们所介导的IL-6信号转导功能的差异。结果：突变体H280I比天然sIL-6R具有更高的IL-6结合能力，但拮抗IL-6在两种效应细胞系上的信号传递功能。结论：第280位His残基对sIL-6R发挥正常生物学功能具有重要影响，是符合拮抗剂设计要求的一个很好的候选位点。

中国图书分类号R392.11

Expression and biological activity analysis of human soluble IL-6R and its mutant

SONG Lun，REN Yun-Fang，WANG Jian-An et al.

Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850

Abstract Objective:To study the structure-function relationship of human soluble IL-6 receptor(hsIL-6R) and lay a foundation to design the antagonists.Methods:The sIL-6R gene was obtained by PCR and then histine 280 was mutanted into isolucine with site-directed mutagenesis system.The expression plasmids of the two genes were introduced into COS7 cells and then the expressed products were confirmed by ELISA and Western blot.IL-6 binding abilities were measured by binding assay ELISA.The biological function analysis of the expressed products on the IL-6 responsive cells indicated their different abilities of signal transduction.Results:The mutant H280I had higher IL-6 binding ability than that of wtsIL-6R,but showed antagonistic function on IL-6 signal transdution.Conclusion:H280 played an important role in the function of sIL-6R and might be used as a target site for the antagonist design.

Key words Human soluble IL-6R Mutant Biological activity

IL-6是一种多功能的细胞因子，它的多功能性是由其受体介导的。IL-6R由α、β两条链组成，二者都具有膜结合性和可溶性受体两种形式，α链为配基特异性受体(一般称IL-6R)，β链是IL-6类型的细胞因子的公用转导子，也称GP130^［1］，α链具有同IL-6结合并进一步与GP130偶联的能力，它的这种生物学功能是由其胞外区细胞因子结合功能域(也称CBD区)执行的^［2］。目前，对CBD区的结构和功能的研究国外已取得了一定进展，并分别确定了该区域中与IL-6结合以及与GP130结合有关的一些氨基酸残基，其中第280位的His残基是影响sIL-6R与GP130结合能力的决定性因素之一，但基本不影响其与 IL-6 的结合能力^［2，3］。在本文中，我们首先克隆了天然人sIL-6R基因，并进而将第280位的His突变成Ile，即同时改变氨基酸的电荷性质及大小，将二者同时在COS7细胞中表达后，分析它们的生物学性质，为进一步研究sIL-6R空间构效关系打下了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1酶和试剂所用工具酶分别购自Promega公司、Gibco公司。LIPOFECTIN,DMEM,1640为Gibco公司产品。DNA序列分析试剂盒为USB公司产品。“DNA 体外突变系统”(Alters Sites II in vitro Mutagenesis System)为Promega公司产品。sIL-6R抗血清为本室自制。Bio-SAR-IgG、Avidin-HRP购自华美公司。

1.1.2质粒、菌种携带有人IL-6R cDNA的质粒由日本大阪大学Hirano教授惠赠。克隆质粒pALTER-1、菌种JM109由“DNA体外突变系统”提供。表达质粒pSVL、pCMV4为本室保存。

1.1.3细胞株COS7细胞用含10%FCS的DMEM培养基传代培养；7TD1为IL-6依赖的小鼠杂交瘤细胞系，用含10%FCS，5×10^-5mol/L 2-ME的1640培养基传代培养，并添加2 ng/ml的IL-6；R2细胞为LT12细胞(大鼠急性髓系白血病细胞系)转染了人IL-6R基因后建立的细胞系^［4］，对IL-6的反应为生长抑制性，用含10%FCS的1640培养基传代培养。以上细胞系均由本室保存。

1.2方法

1.2.1DNA重组技术参照文献［5］。

1.2.2DNA序列分析采用USB公司Sequence Version 2.0 DNA Sequence Kit，并按其说明书进行。

1.2.3DNA定点突变按Promega公司“DNA体外突变系统”说明书进行并略加改动。

1.2.4脂质体介导DNA转染COS7细胞按Gibco公司的LIPOFECTIN使用说明书进行。

1.2.5sIL-6R的ELISA检测及定量用梯度稀释的标准 sIL-6R(每孔100 μl)包被酶联板，4℃过夜，经1%BSA 37℃封闭2 h后，依次加入sIL-6R抗血清、Biotin标记的SAR-IgG和Avidin-HRP,OPD显色10～15 min，1 mol/L H₂SO₄终止反应。表达上清50 μl与等体积包被液混匀后包被酶联板进行检测。

1.2.6Western blot检测转染细胞上清于20% PEG溶液中，浓缩4～5 h(约15倍)后，取20 μl走SDS-PAGE电泳，经转印、封闭、抗体结合等步骤后显色。

1.2.7Binding assay ELISA法检测sIL-6R与IL-6的结合能力用IL-6(10 μg/ml)包被酶联板(每孔100 μl)，经1%BSA 37℃封闭2 h后，加入梯度稀释的标准sIL-6R，于37℃作用3 h或4℃过夜，再加入sIL-6R抗血清和HRP-SAR-IgG，分别于37℃作用1 h，OPD显色，1 mol/L H₂SO₄终止反应。sIL-6R及突变体基因转染的COS7细胞培养上清经ELISA定量后，以等量水平加入酶联板，稀释液采用无血清DMEM培养基。

1.2.8sIL-6R的生物学活性测定7TD1细胞：参考文献［6］，测试前，用无血清1640培养基洗3次，37℃ 5%CO₂孵箱中饥饿1～2 h后，以5×10⁴ ml^-1的浓度悬浮并接种入96孔板中(每孔100 μl)，每孔加入不同浓度IL-6及等量的天然sIL-6R或其突变体表达上清，按终体积为200 μl在每孔中补加适当体积的10%FCS-140，72 h后加入MTT(5 mg/ml，每孔15 μl)，继续孵育5 h，用10%酸性SDS溶解沉淀过夜，并于570 nm处测定光密度值。R2细胞：细胞按1×10⁵ ml^-1接种入96孔板中(每孔100 μl)，每孔加入不同浓度的IL-6及等量的天然sIL-6R或其突变体表达上清，48 h后加入MTT，以下步骤同上。

2结果

2.1人sIL-6R基因的PCR扩增和克隆分别设计了起始于sIL-6R起始密码子ATG并带有BamHI位点的1号上游引物(5′ATGGATCCATGCTGGCCGTCG-GC 3′)和终止于IL-6R胞外区近膜侧第354位氨基酸残基并带有终止密码子和BamHI位点的2号下游引物(5′TCGGATCCTAGAGGCTTGTCGCATTTGC 3′)；用这对引物以含有人IL-6R cDNA的质粒为模板扩增全长为1 062 bp的sIL-6R基因片段(电泳鉴定结果略)。扩增条件：95℃ 10 min，72℃ 2 min，进入以下5个循环：95℃ 1 min,52℃ 1 min，72℃ 2 min;进入下20个循环：94℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 2 min。

我们选择了由“DNA体外突变系统”提供的能够直接进行定点突变操作的pALTER-1质粒作为克隆载体，将sIL-6R基因片段经BamHI酶切后连入BamHI -CIP处理的pALTER-1载体，获得克隆质粒PA6R，经酶切鉴定PA6R构建正确(电泳结果略)。目的基因片段的全序列(氨基酸序列)分析结果与文献报道一致^［7］。图1A所示为部分核苷酸序列分析结果，其它序列分析结果略。

2.2突变引物设计和目的基因突变第280位的His残基是影响sIL-6R生物学功能的几个关键氨基酸残基之一^［2］，因此我们首先选择该位点进行突变。突变引物设计如下：

(Ile)

5′CATCACTGTGTCATCATCGACGCCTGGAGCGG 3′。

原序列CAC

在该引物的中间位置引入突变核苷酸AT代替原序列CA以实现His→Ile的定点突变，其余序列与原序列相同。该引物加入到突变反应体系后，使目的基因实现了第280位His→Ile的定点突变，该突变体命名为H280I。图1B所示为H280I的部分序列分析结果(突变位置箭头所示)，目的突变位点以外的其余核苷酸序列与天然基因相同。

图1天然sIL-6R及其突变体H280I的部分核苷酸序列分析结果

Fig.1 Sequencing of wtsIL-6R and its mutant H280I gene

Note:A:wtsIL-6R gene;B:sIL-6R H280I gene

2.3表达质粒的构建及鉴定pSVL和pCMV4真核表达载体分别由SV40晚期启动子和人CMV启