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中国图书分类号R392.12
Mutation of tyrosines in the cytoplasmic domain of CD3ε
blocks the apoptotic signaling pathway of T lymphocytes
HE Yi-Ping,LIU Yan-Xin,XIAO Sheng et al.
National Laboratories of Medical Molecular Biology,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100005
Abstract Objective：To study the effect of the mutation of two tyrosines in CD3ε-ITAM on apoptotic signaling pathway by using the cell lines stably expressed CD8ε chimera molecule and its mutants of tyrosines to phenolanalines in CD3ε-ITAM as models.Methods：The cells were stimulated with anti-CD8 monoclonal antibody and the protein phosphorylation was analyzed by Western-blot,concentration of Ca2+ analyzed by flow cytometry and nur77 and fas gene expressions determined by Northern-blot and RT-PCR respectively.Results:It was showed that the protein phosphorylations and intracellular concentrations of Ca2+ were increased,nur77 and fas gene expressions upregulated in the cells with expression of CD8ε+,but not in the cells with the expression of CD8ε mutants.Conclusion:It was found at the first time that mutation of any one of the two tyrosines in CD3ε-ITAM blocks the apoptotic signaling pathway mediated by CD3ε molecule.
Key words Cell apoptotic signalingMutation of tyrosinesCD3ε molecule
T淋巴细胞抗原受体(TCR)与CD3分子各亚单位(CD3γ、δ、ε和ζ)形成稳定的复合物，传递外界抗原刺激信号，引起细胞的激活或凋亡。T细胞激活和凋亡信号的传递主要是通过CD3ε和CD3ζ两个亚单位传递的，CD3ε和CD3ζ胞浆区含有保守的免疫受体酪氨酸激活基序(immune receptor tyrosine-based activation motif，即YXXL(X)YXXL/I7-8，简称为ITAM)，TCR/CD3的刺激信号使ITAM中的酪氨酸快速磷酸化，其下游的蛋白酪氨酸激酶（PTKs），如ZAP-70、Lck和Fyn等与酪氨酸结合而活化，从而诱导一系列胞内生化事件，如相关蛋白的磷酸化、胞浆Ca2+浓度升高、Ras-GTP积累、转录因子活化等，最终激活一系列基因表达，使T细胞激活［1］。
本实验室以往的研究中，构建了CD8α胞外区、跨膜区和CD3ε胞浆区（含ITAM）的融合基因（CD8ε），并转染CD8阴性的Jurkat细胞，经G-418筛选获得了稳定表达CD8ε的细胞株（命名为T-JK），用抗CD8单抗刺激能诱导T-JK细胞凋亡［2］。将此融合基因胞浆区ITAM中两个酪氨酸分别突变或同时突变为苯丙氨酸的CD8ε（Y170F）、CD8ε（Y181F）和CD8ε（Y170F/Y181F）分别转染Jurkat T细胞，获得稳定表达的各细胞株分别命名为T1-JK、T2-JK和T3-JK。在同样条件下，抗CD8单抗刺激不能引起T1-JK、T2-JK和T3-JK细胞凋亡［2，3］。此结果表明CD3εITAM中的两个酪氨酸不仅在介导细胞激活中，而且在介导细胞凋亡中均起必不可少的作用。但CD3ε介导的T细胞凋亡的信号传递途径仍不明了，本文进一步探讨了CD3εITAM中两个酪氨酸位点的突变对下游细胞凋亡信号的影响。
1材料与方法
1.1蛋白酪氨酸磷酸化的检测本实验室已经构建的野生型CD8ε、突变型CD8ε（Y170F）、CD8ε（Y181F）和CD8ε（Y170F/Y181F）融合基因转染CD8-Jurkat细胞后，所获得的4株稳定表达上述融合蛋白的细胞株分别命名为T-JK、T1-JK、T2-JK和T3-JK［3］。取1×106细胞，用PBS洗1次，离心弃上清，细胞悬浮于100 μl含20 μg/ml抗CD8单抗并已预热至37℃的PBS中，细胞刺激3 min后，加入1 ml预冷的PBS终止刺激。同时设不经抗体刺激的阴性对照。离心收集细胞，按常规方法裂解细胞，总蛋白经SDS-PAGE电泳分离，转印至NC膜，用抗磷酸化酪氨酸（PTyr）单抗（PY20）进行Western蛋白免疫印迹，用碱性磷酸酶显色系统(B.M公司）显色。
1.2胞浆Ca2+浓度的检测1×106细胞用Hank's平衡盐水（HBSS）洗2次，再将细胞悬浮于1 ml HBSS，加入5 μlCa2+探针Fluo-3/AM（Molecular Probes公司，1 mmol溶于DMSO），使终浓度为5 μmol/L，于37℃保温30～60 min。HBSS洗1次，细胞再悬浮于HBSS中。先不加抗体，以流式细胞仪分析胞浆Ca2+浓度。然后加入含抗CD8单抗的PBS（抗体终浓度为20 μg/ml），刺激细胞1 min，立即用流式细胞仪分析Ca2+浓度的变化。
1.3nur77基因表达的检测将5×106各转染细胞不经抗体刺激或于150 μg/ml抗CD8单抗包被过的培养皿中刺激1、2和4 h后，离心收集细胞并提取总RNA，进行甲醛凝胶电泳后，按常规方法转至NC膜。以nur77 cDNA片段为模板，随机引物法标记探针。65℃预杂交液(0.25 mol Na2HPO4,pH7.4,7%SDS)中杂交30 min，加入标记好的探针杂交过夜。然后按常规进行洗膜，X光片曝光，洗片和观察杂交结果。
1.4fas基因表达的检测5×106转染细胞不经抗体刺激或于150 μg/ml抗CD8单抗包被过的培养皿中刺激4 h，离心收集细胞，用一步法提取总RNA。按下述方法进行RT-PCR反应：总RNA 3 μg（8 μl）,Oligo（dT）2.5 μl和ddH2O 4.0 μl，混匀，离心，于95℃加热2～3 min后取出，缓慢冷却至室温。加入1.0 μl RNasin（50单位）、2.5 μl 10×逆转录反应缓冲液、2.5 μl 10×dNTP、2.5 μl BSA（1 mg/ml）和2.0 μl MMLV逆转录酶（Biolab，100单位），置37℃水浴反应1.5 h。接着进行PCR反应，fas的引物为：
fas:P1: 5′-CCGCCGCTCGAGTTATCGTCCAAAA-3′
P2: 5′-CGGCTCGAGTTATCCTTCCTCTTTGC-3′；
GAPDH：P1: 5′-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3′
P2: 5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。
PCR的条件为：2.5 μl 10×PCR缓冲液、1.5 μl dNTP、2.5 μl DMSO、1.0 μl P1、1.0 μl P2、3.0 μl逆转录产物、加双蒸水至总体积25.0 μl。94℃变性4 min，加入0.3 μl Taq酶，以50.0 μl矿物油覆盖。按94℃变性40 s、58℃退火1 min、72℃延伸40 s的条件，进行30个循环反应。同时以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)cDNA引物进行PCR，作为内对照。
2结果
2.14株转染细胞内蛋白酪氨酸的磷酸化如图1所示，4株转染细胞经抗CD8单抗刺激后，蛋白质酪氨酸磷酸化增加，但T-JK细胞的磷酸化蛋白的种类和强度都高于3株表达CD8ε突变体的细胞。在T1-JK和T2-JK细胞中，其ITAM中的一个酪氨酸突变即可影响蛋白质的酪氨酸磷酸化。但在未受抗体刺激时，T1-JK和T2-JK细胞与野生型T-JK细胞相比，各有一种蛋白质发生显著的酪氨酸磷酸化，提示两个酪氨酸可能有不完全相同的功能。
图1抗CD8单抗刺激前后4株转染细胞内蛋白质酪氨酸磷酸化的分析结果
Fig.1Protein phosphorylation in transfectants stimulated with anti-CD8 mAb
Note:1, 3, 5 and 7. T-JK, T1-JK, T2-JK and T3-JK cells without Ab Stimulation. 2, 4, 6 and 8. T-JK, T1-JK, T2-JK and T3-JK cells stimulated with Ab
2.24株转染细胞内Ca2+浓度的变化将4株转染细胞先经Ca2+探针Fluo-3/AM处理，再用抗CD8单抗刺激1 min，以流式细胞仪测定抗体刺激前后细胞的荧光强度表示胞浆Ca2+浓度的变化。结果如图2所示，抗体刺激后，只有T-JK细胞胞浆Ca2+浓度迅速升高，T3-JK细胞没有变化，表明CD8ε的ITAM中两个酪氨酸同时突变，阻断了抗体刺激信号引起的Ca2+浓度变化。但有趣的是，在只有一个酪氨酸突变的T1-JK和T2-JK细胞中，胞浆Ca2+浓度略有下降，提示这两个酪氨酸的信号传递功能并不完全相同，也不是二者功能的简单叠加。
