中国图书分类号R730.53

摘要目的：研究制备抗皂角毒和表皮生长因子受体双功能抗体，用以导向皂角毒杀伤肿瘤细胞。方法：在制备EQ₇₅、CY12.14单克隆抗体细胞株的基础上，通过杂交-杂交瘤技术制备双功能抗体细胞株。结果：双功能抗体(EQ₇₅×CY12.14)与单用皂角毒杀伤肿瘤细胞(A₄₃₁)的IC₅₀分别为10^-9.6、10^-8.4 mol/L。结论：双功能抗体(EQ₇₅×CY12.14)杀伤肿瘤细胞(A₄₃₁)，以IC₅₀值计算，有效率为单用皂角毒的15倍左右。

In vitro study on cytotoxicity and the preparation of anti-Saporin/anti-EGFR bispecific antibody

ZHANG Shang-Quan, YAN Yuan-Chang, ZHAO Feng et al.Shanghai Institute of Cell Biology,Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031

Abstract Objective:To analyses and prepare the bispecific monoclonal antibody of anti-Saporin and anti-epidermal growth factor receptor(EGFR) which can enhance the effectiveness of tumor cell killing activity.Methods:On the basis of establishing the cell lins which produce monoclonal antibody against EGFR(EQ₇₅) and Saporin (CY12.14) hybri-hybridoma technique was used to construct the cell line of bispecific monoclonal antibody against Saporin and EGFR.Results:IC₅₀ of the bispecific monoclonal antibody and only saporin are 10^-9.6 mol/L and 10^-8.4mol/L respectively in tumor-killing cell (A₄₃₁).Conclusion:The effectiveness measured by IC₅₀ which bispecific antibody(EQ₇₅×CY12.14)tumor-killing cell(A₄₃₁),is about 15 times more than that of which only saporin dose.

Key words Bispecific antibody Saporin Epidermal growth receptor

继单克隆抗体制备发展成为双功能单克隆抗体（BSAb），迄今，已在肿瘤、感染性疾病及免疫组化、检测等方面得到广泛的应用与研究。尤其在肿瘤治疗方面，国外研究甚多，国内已有肝癌、肺癌、胃癌等单克隆抗体都已进入临床试验。EGF-R单克隆抗体也得到很多研究工作者的关注，文献表明许多肿瘤表面过度表达EGF-R，如非小细胞肺癌、肝癌、胶质瘤、鳞癌、恶性表皮癌等表面过度表达的EGF-R可达1×10^6［1］，而一般哺乳类动物上皮细胞含量极微，并且证明EGF-R 与编码 C-erbB-2 癌基因产物同源，EGF-R和erbB-2与肿瘤的形成密切相关。

细胞表面EGF-R与自/旁分泌异常的配体EGF/TGF-α结合后，促进细胞的恶性增殖和细胞的转化，过量的EGF-R单抗与EGF-R结合，可有效地竞争性地阻断EGF/TGF-α与EGF-R结合从而抑制肿瘤细胞恶性发生与发展^［2］。另外，人们所熟知的某类肿瘤单克隆抗体只能针对某类肿瘤细胞表面的某种抗原决定簇，因此单一的肿瘤单抗往往因为其肿瘤抗原的调变或其肿瘤表面抗原的异质性，使肿瘤单抗导向治疗效果不十分明显，而EGF-R单抗则有效地避免了肿瘤导向治疗中的这类弊端。

1材料与方法

1.1CY12.14单克隆抗体的亚型鉴定抗Saporin的单克隆抗体细胞株CY12.14（Prof.Ferrini实验室）培养至5×10⁶细胞/0.5 ml注射BALB/C小鼠产生腹水，应用protein A Sepharose (Kit)分离CY12.14单抗，CY12.14抗体经SDS-PAGE 10％胶电泳(图略)，最后用Bio-Red公司抗体作亚型分析(Kit，catalog number 172-2055)。

1.2CY12.14单抗的免疫印迹实验(Western blot)将Saporin 用 SDS-PAGE 电泳样品缓冲液稀释 10 μg/ml（100℃×5 min）与 ¹⁴C- Lucin标记标准分子量分别上12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取出电泳胶，转移至Immobilon膜（12 mA，40 min），将印迹膜取出，切割 ¹⁴C- Lucin标准分子量膜带，以PBS 0.02%叠氮钠保存。样品膜带以TTBS（20 mmol/L Tris, pH 7.4, 0.05% Tween 20,0.14 mol/L NaCl）和2.3％脱脂奶室温振荡处理1～2 h，洗涤后样品膜带加CY12.14单抗，另外取一条样品膜带加非相关性抗体作为阴性对照，室温内振荡1 h，再经TTBS 2.3％脱脂奶洗涤4次后，分别加 ¹²⁵I-兔抗鼠IgG（大约2×10⁵cpm/ml）振荡培养1 h后洗涤干燥，在暗盒内与Immobilon-p-teflon胶片自动曝光(图1)。

图1CY12.14单克隆抗体与对应抗原皂角毒的免疫印迹分析

Fig.1Immunoblot analysis of the saporin which use the monoclonal antibody(CY12/14) to detect

Note:1. ¹⁴C-Lucin protein molecular weight marker. 2. 1 μg/ml Saporin. 3. 0.1 μg/ml Saporin. 4. 10 μg/ml Saporin. 5. 5 μg/ml Sporin. A.The immobilon straps(2,3,4) incubate with CY12.14 and add the second reagent ¹²⁵I-RAM IgG，show blot(29 kD) in film. B. The immobilon strap(5) incubate with no specific antibody and add the second reagent ¹²⁵I-RAM IgG.strap(5) shows insensible blot(29 kD) in film

1.3EGF-R单克隆抗体（EQ₇₅）免疫组化分析方法参考文献［3］。

1.4EQ₇₅抗肿瘤细胞株的免疫荧光测定^［4］将若

干管肿瘤细胞株A₅₄₉、A₄₃₁、SPC A1 （5×10⁴/管）分别加入50 μl EQ₇₅单抗细胞株培养上清及加入非相关性抗体作为对照组。方法参见本文1.6.1。

1.5杂交-杂交瘤细胞株的制备^［5］CY12.14经1～20 γ/ml的8-杂氮鸟嘌呤RPMI1640培养液培养筛选出HRPT 酶缺失的 CY12.14杂交瘤细胞株。将EQ₇₅（HRPT^＋） 1×10⁷杂交瘤细胞株用PBS洗涤，在1 mol/L iodoacetamide(Sigma公司) 10 ml PBS 保存（4℃）30 min，PBS洗涤，然后与5×10⁷CY12.14（HRPT^-）杂交瘤细胞株混合，用RPMI1640无血清培养液洗涤，按常规融合方法，融合细胞在37℃ CO₂ 孵箱内培养，48 h后用HAT RPMI1640 10％FCS选择培养基。

1.6二次杂交瘤（抗EGF-R×CY12.14）筛选和鉴定筛选融合细胞的96孔板中，发现近20％孔生长有单个簇型细胞，然后将此类孔上清液分两步进行筛选。

1.6.1将上清50 μl加入5×10⁴A₄₃₁/管中，4℃30 min，洗涤后加羊抗鼠IgG-FITC，4℃30 min，洗涤后流式细胞仪定量荧光分析（图2）。

图2ZY₁₆以A₄₃₁为靶抗原经免疫荧光FACS分析图示

Fig.2 Immunofluorescence results of FACS of ZY₁₆ which using A₄₃₁ as the target Ag

Note:ZY₁₆ is assayed to appear positive rate 94% by FACS

1.6.2另一部分上清加入预先100μl皂角毒（3 μg/ml）包被的96孔板（Boehringer,Elisa Kit），测定OD_{405 nm}值，选择对A₄₃₁及免疫结合皂角毒素为强阳性值的孔进行单克隆化筛选4～5次 ， 筛选方法与上述相同。单克隆化后96孔阳性分布率为100％，其中一株双阳性细胞命名为ZY₁₆。

1.7ZY₁₆导向杀伤靶细胞试验^［6，7］培养A₄₃₁细胞0.5×10⁶ ml^-1，分装于96孔板，每孔100 μl，然后加ZY₁₆培养上清50μl/孔置冰浴中30 min，洗涤2次，阳性对照孔分别加入兔抗鼠抗体与Saporin的交联物（RAM IgG-Saporin），按Saporin浓度计算10^-7～10^-11mol/L（Inland 实验室）。样品加入 Saporin 10^-6

～10^-11 mol/L，冰浴30 min，置CO₂孵箱37℃培养48 h，加³H亮氨酸1μCi/ 孔继续培养20 h，离心去除上清，沉淀加生理盐水洗1次，用低渗液破碎细胞，用多孔负压吸附仪，将每孔细胞吸附在纤维滤膜纸上，洗涤后同位素计数，计算双功能抗体的杀伤率。

2结果

2.1EQ₇₅单抗经免疫组织化学分析（ABC法），人的主要器官心、肝、肺、胃等正常组织为阴性，人肝癌、肺腺癌、肺鳞癌组织标本为阳性。

2.2EQ₇₅对表皮癌细胞系A₄₃₁、肺癌细胞系A₅₄₉，SPC A1、肝癌细胞系SMMC772