中国图书分类号R378.4Q784

摘要目的：对重组杆状病毒表达的经多种信号序列修饰的天然和变异百日咳毒素(PT)S1亚单位(rS1)的生物学及免疫学特性作出评价。方法：应用生物化学和免疫学技术与方法对这些rS1的酶活性、分泌性和免疫原性等做了系统鉴定。结果：rS1变异子无可检出的酶活性；所有rS1均不能由细胞分泌，可从细胞膜组分中大量检出，但不能从可溶性胞浆蛋白组分或细胞培养上清中检出；rS1分子内部含有3个疏水性区域；rS1虽不能与B寡聚体结合形成PT全毒素，但均能诱导抗PT免疫应答。结论：这些rS1极可能以膜蛋白形式存在，其非分泌性与分子内部的疏水性区域有关；所有rS1均保持其免疫原性。

Biological and immunological characterization of genetically altered S1 subunits of pertussis toxin expressed in recombinant baculoviruses

YU Kang-Zhen.Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001

Burnette W N, Kaslow H R, Yilma T D.International Laboratory of Molecular Biology for Tropical Disease Agents, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, CA 95616 USA

AbstractObjective:To make a further study on the biological and immunological aspects of the molecularly modified native and mutant rS1 subunits abundantly expressed by recombinant baculoviruses in insect cells and larvae.Methods:Biochemical and immunological techniques were used for characterization of enzyme activity, secretion and immunogenicity of the rS1.Results:The mutant rS1 analogs had no detectable enzymatic activity. None of the rS1 subunits were secreted from the eukaryotic cells. These rS1 proteins were found in membrane fractions, but not in either the soluble cytoplasmic or culture supernatant fractions. Furthermore, 3 hydrophobic domains were found within the rS1 molecules. Although none of the rS1 subunits were capable of associating with authentic B oligomer to form PT holotoxin, they induced an immune response to PT in Balb／c mice.Conclusion:Those rS1 subunits appeared to be integrated into the cell membrane,and their none-secretion might be contributed by the hydrophobic domains. The immunogenicity of the all rS1 subunits was still maintained.

Key wordsPertussis toxinS1 subunitBiological characterizationImmune response

百日咳是一种在婴儿中具有很高死亡率的呼吸系统疾病，其病原为百日咳杆菌，该菌能产生包括百日咳毒素(PT)在内的十多种毒性因子。PT既是百日咳杆菌的主要毒性因子，又是百日咳疫苗的主要保护性抗原。S1亚单位是PT中最大的一个亚单位，PT的ADP-核糖转移酶活性和主要保护性决定簇即位于该亚单位上。传统百日咳疫苗的毒副作用与S1亚单位的酶活性有关。

Burnette及其同事通过单一氨基酸替换(R9→K)技术构建了一种S1变异子，其酶活性降至阴性对照水平，但仍保持主要的保护性决定簇^［1］。这一突破为有效和安全的新型百日咳疫苗的研制开辟了新途径。在先前的研究中，我们对天然及变异S1编码基因进行了一系列分子修饰，并应用重组杆状病毒(rBV)技术实现了这些亚单位在昆虫细胞中的高水平表达。本研究中，我们进一步对这些重组S1亚单位(rS1)的生物学及免疫学特性作了鉴定，为评价其作为安全免疫原的潜能提供了分子生物学依据。

1材料与方法

1.1细胞系、病毒昆虫细胞系Sf21用于rS1亚单位的表达，中国地鼠卵(CHO)细胞、Vero细胞及牛水疱性口炎病毒(VSV-NJ株)用于rS1亚单位生物学特性的鉴定。

1.2S1亚单位基因片段的修饰和表达8种S1亚单位编码基因片段的遗传学修饰如图1所示，其在rBV中的高效表达见文献［2］。

图1S1亚单位编码基因的分子修饰

Fig.1Modification of S1 DNA molecules

1.3ADP-核糖转移酶活性分析用于评价各rS1亚单位的酶活性，具体方法参照文献［3］进行，以牛的Transducin作为ADP-核糖转移酶的底物。

1.4rBV感染培养物各组分的制备细胞膜及其它亚细胞成分的制备按报道的方法进行^［4］。用各rBV感染Sf21细胞^［2］，低速离心(280×g)收集细胞沉淀后进行匀浆。全细胞裂解物(组分1)经离心(110 000×g)后形成两部分，一为上清液(组分2，可溶性胞浆蛋白)，将其用Centricon-10滤膜(截留分子量为10 kD，Amicon)超滤浓缩10倍；另一部分为沉淀(组分3，不溶性蛋白)，将其重悬于1.42mol/L STE(1.42 mol/L蔗糖，5mmol/L Tris和1mmol/L EDTA)并离心(110000×g),离心后形成新的沉淀(组分4，亚细胞成分)和一条含膜组分(组分6)的条带。对最初低速离心所获得的上清再进行超速离心(110000×g)，新上清用Centriprep-10(截留分子量为10kD，Amicon)滤膜浓缩100倍(组分5)。同时用各rBV感染昆虫幼虫^［2］，收获其血淋巴(组分7)。用免疫印迹技术检测以上各组分中的rS1蛋白。

1.5全毒素组装分析即测定这些rS1与PT的B寡聚体结合能力^［5］。组装的全毒素用免疫印迹技术检测，同时对反应混合物作CHO聚集效应分析^［6］。

1.6rS1亚单位免疫学特性试验

1.6.1动物免疫为检测rS1的免疫原性及佐剂活性，以rVSV-G(rBV表达的VSV糖蛋白)和下列各rS1的混合物经腹腔免疫：带有天然信号序列的天然rS1(rS1／1组)，带有天然信号序列的变异rS1(rS1／1-4组)，带有流感病毒信号序列的变异rS1(rS1／3-4组)，纯化的PT(PT组)，纯化的S1(S1组，阳性对照)和磷酸盐缓冲液(rVSV-G组，阴性对照)。每只鼠免疫剂量为rS1 30 μg(据SDS-PAGE凝胶扫描结果估算)，PT或S1亚单位1 μg。

小鼠在免疫前经眶后静脉采血1次，免疫后每周以相同的途径采血，并进行白细胞(WBC)计数。

1.6.2ELISA试验用以评价免疫鼠的抗PT或VSV-G的免疫应答。简言之，以含1 μg/ml PT或VSV-G的碳酸盐缓冲液(pH9.6)包被96孔酶标板，然后以含5%脱脂奶粉的TBS(pH7.4)封闭，再将不同稀释度的鼠血清样品加入各孔,然后加入碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG,按常规显色和测定。

1.6.3CHO细胞聚集抑制试验用以检测抗PT的中和性抗体。试验在96孔组织培养板上按文献［6］报道的方法进行。PT的血清中和(SN)价以可完全抑制CHO细胞聚集的血清终点稀释度的倒数表示。

1.6.4VSV蚀斑减少试验用以分析rS1能否增强小鼠对VSV的体液免疫应答。免疫鼠血清与VSV-NJ在96孔板上混合后作用1 h，然后用该血清／病毒混合物感染Vero细胞单层，VSV蚀斑用结晶紫染色后计数。VSV SN滴度以无病毒蚀斑形成时的终点血清稀释度的倒数表示。

1.7疏水性分析为探讨rS1亚单位不能分泌的可能原因，我们利用计算机辅助分析技术和GCG程序(Wisconsin package)对本研究中具有代表性的rS1／3-4亚单位分子的疏水性作了分析。

2结果

2.1rS1亚单位的酶活性ADP-核糖转移酶试验表明，所有天然序列的rS1亚单位均具有酶活性，而所有变异的rS1亚单位均无可检出的酶活性。

2.2rS1蛋白的亚细胞分布及其分泌性对8种rBV感染的细胞培养物的不同组分进行了检测，结果是一致的(图2)：在昆虫血淋巴、高度浓缩的培养上清及胞浆可溶性蛋白组分中未检出任何rS1亚单位，而在膜组分中检出了大量的rS1蛋白。结果表明，所有rS1亚单位(无论有无信号序列)均不能分泌，而是膜结合性的。

图2rS1蛋白在昆虫细胞培养物中的亚细胞分布

Fig.2Subcellular distribution of rS1 proteins in different fractions of insect cell cultures

Note：subcellular fractions are indicated as 1～7, see1.4 in methods for detail

2.3全毒素装配分析未能从含rS1的全毒素组装反应混合物中检出PT全毒素，而从含天然S1的反应混合物中检出了PT。CHO细胞聚集试验表明，25%～50%的天然S1可与B寡聚体组装成PT全毒素，而rS1亚单位的全毒素装配均处于本底水平(＜0.4%)。因此，所有rS1亚单位均缺乏与B寡聚体结合的能力。

2.4rS1亚单位的白细胞增多活性WBC计数表明，注射天然PT 1 w后的小鼠具有<