中国图书分类号R378.4Q784

摘要目的：百日咳毒素既是百日咳杆菌的主要毒性因子，又是重要的保护性抗原，其S1亚单位具有ADP-核糖转移酶活性和免疫保护性决定簇。为高效表达前构建的一个丧失酶活性但仍保持保护决定簇的S1变异子，开展了本研究。方法：通过添加人流感病毒血凝素基因信号序列或嵌膜序列的方法，对天然和变异S1亚单位基因片段作了遗传学修饰。然后使用重组杆状病毒技术使这些S1亚单位在昆虫细胞和昆虫幼虫中实现了高水平表达。结果：这些重组S1的表达水平介于每万个昆虫卵细胞0.18～1.93 μg或每只昆虫幼虫0.46～4.98 mg之间。天然信号肽和HA信号肽均可完整表达，但后者的切割效率(61%～81%)比前者(16%～19%)更高。所有带信号肽的S1亚单位均呈异质性表达(双带)。结论：重组S1亚单位的表达是高效和正确的，表达的异质性是由于信号肽切割不完全的缘故。

Expression of genetically altered S1 subunits of pertussis toxin in recombinant baculoviruses

YU Kang-Zhen.

Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001

Burnette W N,Kaslow H R,Mar V L et al.

International Laboratory of Molecular Biology for Tropical Disease Agents,School of Veterinary Medicine,University of California,Davis,CA 95616

AbstractObjective:Pertusis toxin(PT)is both a major virulence factor of bordetella pertussis and an important immunoprotective antigen against whooping cough.The S1 subunit of PT possesses ADP-ribosyltransferase activity as well as epitopes that induce protective immunity.The aim of the present research is to produce the S1 mutant abundantly which is in lack of the enzyme activity constructed previously.Methods:Have modified both native and mutant S1 subunit-encoding DNA fragments by the addition of the native S1 signal sequence or the signal sequence of human influenza virus hemagglutinin(HA) gene.The modified S1 subunits were abundantly expressed by recombinant autographa californica nuclear polyhedrosis viruses in insect cells and larva.Results:The expression levels ranged from 0.18～1.93 μg/10⁴ spodoptera frugiperda ovarian cells,or 0.46～4.98 mg/larva of spodoptera exigua.The native and HA signal sequences were both expressed intact,although the HA signal was processed more efficiently(61%～81%) tnan the native one(16%～19%).All S1 with signals produced two bands.Conclusion:All recombinant S1 subunits were produced correctly to high levels.The heterologous expression of rS1 proteins is the result of incomplete signal cleavage.

Key wordsPertussis toxin(PT)S1 subunitRecombinant baculovirus(rBV)Expression

百日咳是一种严重的呼吸系统疾病，有时伴有神经症状。其病原菌——百日咳杆菌能产生十多种毒性因子，其中的百日咳毒素(PT)是一种外毒素，由5种不同亚单位组成A-B结构。A结构即S1亚单位，分子量为26 kD，具有鸟嘌呤结合蛋白(G蛋白)特异性核糖转移酶活性，而G蛋白与腺苷酸环化酶抑制信号的传导有关。由于PT可与多种细胞结合，从而抑制G蛋白介导的多种信号传递系统，产生细胞毒性作用。传统百日咳疫苗的毒副作用与S1亚单位的酶活性有关。近年研究均致力于S1亚单位的遗传学脱毒。Burnette等应用定点突变术构建了一种S1变异子(Arg 9→Lys，或R9→K)^［1］，其酶活性降至阴性对照水平，但仍保持其保护性抗原决定簇，这为安全有效的新型百日咳疫苗的研制打下了基础。重组杆状病毒(rBV)载体以其高效、真实地表达外源基因的特性而被广泛应用。本研究中，我们对天然及变异S1亚单位编码基因进行了一系列分子修饰，并用rBV载体系统高水平地表达了这些重组S1亚单位，为其免疫学特性评价奠定了基础。

1材料与方法

1.1菌株、病毒及细胞系大肠杆菌DH5α株用于质粒扩增；野生型杆状病毒Autographa california核多角体病毒株(wtAcNPV)用于同源重组；昆虫(Spodoptera frugiperda)卵细胞系Sf9和Sf21用于rBV增殖和蛋白质表达。

1.2主要试剂工具酶及DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim)；杆状病毒转移载体质粒pVL1392和pVL1393(Invitrogen)；PT及S1亚单位(List Biological Laboratory公司)；兔抗PT高免血清的制备见文献［2］；抗S1亚单位单克隆抗体1B7由Sato博士惠赠^［3］；碱性磷酸酶标记的多克隆羊抗兔或鼠IgG抗体(ZymedLaboratory公司)；蛋白定量试剂盒(Sigma)。

1.3S1亚单位编码基因的修饰在编码天然S1亚单位DNA片段的克隆和定点突变的基础上^［1，2］，使用pUC18及pUC19载体构建了遗传学修饰的S1 DNA克隆(图1)。流感病毒血凝素(HA)信号序列(77 bp)和嵌膜序列为人工合成^［4，5］。应用双脱氧序列分析技术确证这些S1 DNA片段序列的正确性。

图1S1亚单位编码基因的分子修饰

Fig.1Modification of S1 DNA molecules

1.4杆状病毒转移载体的构建上述8种pUC重组质粒(pUCS1)分离相应的S1 DNA片段，分将其亚克隆到杆状病毒转移载体pVL1392或pVL1393(视克隆方向而定)中。原位杂交和酶切分析筛选和鉴定重组pVL质粒(pVLS1)。

1.5DNA转染及rBV纯化采用线性AcNPV转染技术(Invitrogen公司)。3轮蚀斑筛选和纯化后将斑点杂交和免疫斑点试验双阳性的病毒蚀斑克隆在Sf9细胞中增殖。

1.6原位及斑点杂交采用随机引物标记技术将S1/2 DNA片段经³²P标记后用作探针，检测重组菌落的rBVs中的S1 DNA。菌落的原位杂交按常规方法进行。斑点杂交时先将rBV感染的细胞用1 mol/L NaOH裂解后加到硝酸纤维素膜上，进行杂交。

1.7SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、免疫印迹(Western blot)和免疫斑点(Immunoblot)试验

1.7.1SDS-PAGE感染样品(Sf21细胞、昆虫幼虫或血淋巴)经SDS-PAGE分离，分离胶浓度为12%。以纯化的PT作阳性对照，wtAcNPV感染的昆虫幼虫或表达牛水疱性口炎病毒核蛋白(VSV-N)的rBV感染的Sf21细胞用作阴性对照^［6］。

1.7.2免疫印迹参照文献［7］进行。以兔抗PT高免血清、抗S1亚单位的单克隆抗体(1B7)和碱性磷酸酶标记的羊抗兔(或鼠)IgG用于免疫学检测。

1.7.3免疫斑点方法与免疫印迹相似，不同：1.待测样品经超声裂解后溶于Tris缓冲盐溶液(TBS，pH 7.4)中，然后直接点到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上；2.纯化的S1亚单位作rS1定量的标准。PVDF膜用轻矿物油透明后进行定量扫描分析。

1.8rS1表达水平的测定

1.8.1rS1表达动力学分析用10个感染量(m.o.i.)的rBV感染Sf21细胞，在不同时间收集这些细胞，进行免疫斑点试验，分析rS1亚单位的表达动力学，以据此在最佳时间收集表达的S1蛋白。此外，用5×10⁵个蚀斑形成单位(pfu)的rBV感染昆虫幼虫(Spodoptera exigua，体重0.65～0.71 g)，感染后第4天收集幼虫及其血淋巴。

1.8.2rS1表达量的测定rBV感染的昆虫细胞或昆虫幼虫悬液总蛋白用蛋白定量试剂盒(Lowry法)测定。对每个样品进行SDS-PAGE分析，根据rS1蛋白在总蛋白中的百分比和总蛋白浓度计算出每种rS1亚单位的表达量。除使用该物理定量法外，还同时应用免疫斑点试验(免疫定量法)测定了每种rS1亚单位的表达量。

1.9rS1亚单位信号肽处理的分析将rS1蛋白经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，然后用考马斯亮蓝染色。将rS1条带逐一切下，加到ABI 477气相微量序列测定仪中作N端氨基酸序列分析(10个循环)。同时，rS1蛋白经免疫印迹分析并用轻矿物油对印迹膜透明处理后，对特异条带体积进行定量扫描。微量序列分析证实低分子量条带缺乏信号肽以及高分子量条带含有信号肽后，信号肽的切割效率按低分子量条带体积与两条带总体积之比计算。

2结果

2.1rBVs的构建将修饰后的S1 DNA分子从相应pUCS1质粒中切下并分别亚克隆到杆状病毒转移载体中。然后通过重组pVLS1 DNA和wtAcNPV DNA在Sf9细胞中的同源重组获得rBV。蚀斑纯化后，利用免疫斑点或免疫印迹试验筛选出了可表达8种不同rS1蛋白的rBV。

2.2rS1亚单位的表达8种不同rBV在昆虫细胞中的表达动力学表明，病毒感染后72 h，rS1蛋白的表达水平最高。由于昆虫幼虫多在感染后5～6 d死亡，故收获rS1蛋白的最佳时间为接毒后第4天。应用SDS-PAGE和免疫印<