中国图书分类号R392.11

摘要目的：克隆和鉴定人淋巴细胞免疫反应性生长激素(irGH)基因调控序列的核苷酸顺序。方法：通过PCR扩增出人淋巴细胞irGH基因5′近端的调控序列，然后将其与质粒PGEM7Zf(+)连接，经转化蓝白斑筛选、酶切鉴定，获得PGEM7Zf(+)-irGH DNA (-484-+2 bp)重组质粒，进行序列测定。结果：显示irGH基因5′近端的调控序列与垂体细胞GH基因的5′近端调控序列的核苷酸顺序完全相同。结论：该结果进一步证明免疫系统与神经内分泌系统的密切关系。

Cloning and nucleotide sequencing of the 5′-flanking region of immunoreactive growth hormone gene of human lymphocyte

WANG Hui,DENG Jie-Ying,ZHENG De-Xian et al.

Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100730

AbstractObjective：Cloning and nucleotide sequencing of the 5′-flanking region of immunoreactive growth hormone gene of human 1ymphocyte.Methods:The immunoreactive growth hormone(irGH) DNA fragments were obtained by PCR with normal human peripheral blood lymphocyte DNA as template.Then,the plasmids of PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+2 bp) were constructed by ligation of irGH DNA with PGEM7Zf(+),transformation,blue/white color selection and restriction enzyme analysis.The 5′-flanking region of irGH were sequenced by using sanger's dideoxynucleitide chain-temination reaction.Results:It was demonstrated that the sequence data of 5′-flanking region(-484-+2 bp) in irGH gene was identical to that of pituitary GH gene.Conclusion:The results indicate a close relationship between immune system and neuroencrine system.

Key wordsGrowth hormone genePromoterLymphocytes

已发现经典的内分泌腺体、神经元、神经胶质细胞能够产生多种细胞因子，中枢及外周免疫器官也能产生多种激素和神经肽，此外还证实免疫系统和神经内分泌系统的细胞能表达细胞因子、激素及神经肽的受体^［1］。淋巴细胞能分泌免疫反应性生长激素(Immunoreactive GH，irGH)，它是淋巴细胞的一种自分泌和旁分泌生长因子，在抗原性、分子量、生物活性及mRNA大小等方面与垂体GH相似。本实验室证实人淋巴细胞表达的irGH cDNA编码序列与垂体hGH cDNA的序列是相同的^［2，3］，但目前有研究表明淋巴细胞分泌GH与垂体分泌GH的调控机制是不同的。本实验室为了从分子水平上探讨淋巴细胞irGH基因表达的调控机制，首先克隆irGH基因的5′上游调控序列，进行序列分析和鉴定。

1材料与方法

1.1菌株及质粒DH5α及PGEM7Zf(+)质粒为本室保存。

1.2试剂内切酶(SmaI、BamHI、EcoRI)、T4 DNA连接酶、Klenow大片段酶、Taq DNA聚合酶、Wizard PCR产物纯化系统、fmol DNA测序试剂盒均为美国Promeaga公司产品。DNA分子量标准λDNA/EcoRI+HindⅢ、PBR322/hinfⅠ为华美公司产品，PCR引物由北京赛百胜(美国)生物工程公司合成，³²P-dATP为北京亚辉公司产品。

1.3PCR引物的设计为了扩增irGH基因5′上游序列，按照文献［4］设计出上游引物(P1)(-484--467 bp):5′-GACTGAATCGTGCTCAC-3′和下游引物(P2)(+441-+464 bp):5′-GGTGCAGACGATGGGCGCGGAGC-3′。

1.4irGH基因(-484-+464 bp)片段的扩增取正常人抗凝外周血，分离出淋巴细胞，用酚抽提法分离DNA，纯化后取300 ng作模板，加2 mmol/L dNTP混合物2 μl和引物P1、P2各200 pmol/L、2.5 U Taq DNA聚合酶，在50 μl终反应体积中按以下方式进行PCR扩增；95℃，5 min；94℃，1 min，60℃，1 min，72℃，2 min，30个循环；72℃，10 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后用Wizard PCR产物纯化系统回收。

1.5irGH(-484-+464 bp)重组质粒的构建首先取3.0 μg PGEM7Zf(+)加入SmaI 20 U，在20 μl反应体系中，25℃水浴水解3 h。然后加入PCR扩增的irGH基因(-484-+464 bp)片段1.6 μg加入5 U Klenow大片段酶、5 mmol/L dNTP 1 μl。12℃水浴3 h，将irGH DNA片段两端补齐。然后加入0.1倍体积的3 mmol/L醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇，放入-20℃冰箱1 h，取出后4℃ 离心，12 000 r/min，30 min，去上清后冷冻干燥3 min，加入下列试剂：6 U T4 DNA连接酶、10×连接缓冲液2 μl、SmaI 10 U、50% PEG8000 6 μl，补足至20 μl，16℃水浴过夜。然后取DH5a感受态细胞100 μl，加入10 μl连接缓冲液进行转化，而后在含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行蓝、白斑筛选，即为irGH(-484-+464 bp)重组质粒。

1.6irGH DNA(-484-+2 bp)重组质粒的构建取数个白色菌落分别种入含有氨苄青霉素(50 μg/ml)LB培养基的试管中，37℃振荡过夜，采用碱裂解法进行质粒的少量提取，1%琼脂糖凝胶电泳，选出PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+464 bp)重组质粒，如图1所示用BamHI酶切、鉴定获得正确的克隆，即irGH (-484-+2 bp)质粒。

1.7irGH基因5′上游核苷酸序列的测定以PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+2 bp)重组质粒为模板，用PUC/M13正反向引物行双链双脱氧DNA人工测序，按fmol测序试剂盒说明进行操作。

图1PGEM7Zf(+)-irGH测序质粒的构建

Fig.1Construction of sequencing plasmid PGEM7ZF(+)-irGH

2结果

2.1PCR扩增irGH基因片段(-484-+464 bp)结果PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳可见一大约900 bp的特异条带，该条带即为包括irGH 5′上游调控序列的DNA片段(-484-+464 bp)。

2.2PGEM7Zf(+)-irGH DNA重组克隆的鉴定PGEM7Zf(+)和irGH DNA(-484-+464 bp)行平端连接后，经蓝、白斑筛选，获得数10个白色菌落。取其中8个白色菌落进行质粒少量提取，琼脂糖电泳分析表明3个质粒为含有irGH DNA(-484-+464 bp)的克隆。然后经BamHI酶切分析，如图2所示，质粒1、2切下的片段小(+3-+464 bp)证明为正向连接，而质粒3切下的片段大(-484-+464 bp)为反向连接。然后将切下了小片段的质粒1、2用T4 DNA连接酶连接，即得到PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+464 bp)重组质粒。

图2重组质粒的琼脂糖电泳

Fig.2Photogram of reconstructed plasmid digested with BamHI and analyzed by electrophoresis in agarose gel containing EB

2.3irGH DNA 5′上游核苷酸调控序列的测定结果如图3，与垂体GH基因的调控序列是一致的。

-484GACTGAATCGTGCTCACAACCCCCACAATCTATTGGCTGTGCTTGGCCCCTTTTCCCAAC

-424ACACACATTCTGTCTGGTGGGTGGAGGTTAAACATGCGGGGAGGAGGAAAGGGATAGGAT

-364AGAGAATGGGATGTGGTCGGTAGGGGGTCTCAAGGACTGGCTATCCTGACATCCTTCTCC

-304GCGTTCAGGTTGGCCACCATGGCCTGCGGCCAGAGGGCACCCACGTGACCCTTAAAGAGA

-244GGACAAGTTGGGTGGTATCTCTGGCTGACACTCTGTGCACAACCCTCACAACACTGGTGA

-184CGGTGGGAAGGGAAAGATGACAAGCCAGGGGGCATGATCCCAGCATGTGTGGGAGGAGCT

-124TCTAAATTATCCATTAGCACAAGCCCGTCAGTGGCCCCATGCATAAATGTACACAGAAAC

-64AGGTGGGGGCAACAGTGGGAGAGAAGGGGCCAGGTATAAAAAGGGCCCACAAGAGACCAG

-4CTCAAG

图3人irGH DNA 5′上游调控核苷酸序列

Fig.3Nucleotide sequence of the 5′-flanking region of irGH gene of human lymphocytes

3讨论

Hiestand等于1986年首先报道了用大鼠的GH和PRL特异性的mRNA探针进行斑点杂交，发现激活的淋巴细胞胞浆中有GH和PRL的mRNA存在^［5］，随后人们就irGH分子量的大小、mRNA的表达量及irGH的分泌等方面进行了研究，证明在胸腺、骨髓、外周血细胞及脾脏分离出的T和B细胞都可分泌irGH。Kao等研究发现GHRH、TRH、CRH、胰岛素、睾酮、雌激素、胸腺素-5、生长抑素、IGF-I、肾上腺素等均不影响淋巴细胞系H9细胞分泌irGH^［6］，Hattori等报道外源性GH能增加植物血凝素(PHA)刺激的人外周血淋巴细胞irGH的分