中国图书分类号R392.4

摘要目的：将HLA-DRB1基因cDNA片段反向插入逆转录病毒质粒ZIP-neoSV(×)Bam HI位点中，构建了HLA-DRB1基因的逆转录病毒反义RNA重组表达载体，用脂质体法导入PA317细胞。方法：用免疫磁珠法分离，富集CD34⁺脐血造血干/祖细胞。含编码人HLA-DRB1基因的pcDV1质粒，用Bam HI酶解，回收HLA-DRB1 cDNA片段，将cDNA片段反向插入pZIP-neoSV(×)逆转录病毒载体，经扩增、抽提、酶切鉴定，用脂质体将反义RNA重组体导入到PA317细胞，用含G418 300 μg/ml培养液筛选，获抗性克隆，流式细胞仪检测HLA-DR抗原阳性细胞数。结果：重组质粒转染PA317细胞后，其病毒滴度达1×10⁵CFU/ml，脐血造血干/祖细胞经免疫磁珠富集后，CD34⁺细胞高达85.0%～90.0%，导入反义RNA的脐血干细胞，其HLA-DR抗原表达从导入前的45.0%降至28.0%，抑制率达38.2%，而导入空载体后从56.0%降至45.0%，差异不显著。结论：HLA-DR的反义RNA能导入脐血干细胞，降低HLA-DR抗原的表达。

Antisense RNA of MHC gene were transducted into CD34⁺ cord blood stem/progenitor cells

DENG Yu-Bin,LI Shu-Nong,LIANG Tian-Wen et al.

Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089

AbstractObjective：To construct the retroviral vector encoding antisense RNA of HLA-DR gene and to transduct into packaging cell line PA317 by lipofectin.Methods:pcDV1 plasmid containing HLA-DRB1 gene (a gift from Dr long,NIH,USA) was distracted by alkaline lysation,and then digested by BamHI.pZIP-neoSV(X)vector digested by BamHI and T4 ligase were mixed with cDNA fragment at 18℃ for 16 h. Mononuclear cells of cord blood were incubated in CD34 monoclonal antibody (Milternyi Biotec,Germany) labeled micromagenetic balls for 12 min.After passing of the solution through the mini MACS column,the CD34 positive cells were collected.Results:A high titer(1×10⁵ CFU/ml) helper-free virus producing cell PA317 was obtained .The CD34⁺ hematopoietic stem/progenitors cells were sorted and enriched by MACS.The percentage of CD34⁺ stem cell was increased to 85.0%～90.0%.The CD34⁺ cells were infected by the viral supernatant.The G418-resistant clone was demonstrated to be able to express the antisense RNA of HLA-DR gene by PCR technique. The expression rate of HLA -DR antigen of cord blood cell detected by FACS was 28.0%,which was apparently lower than that of control(45.0%)with inhibition rate of 38.2%.Conclusion:These results suggested that transduction of antisense RNA of HLA-DR gene into cord blood hematopoietic stem cells can successfully inhibited the expression of HLA-DR antigen.These would provide evidences for the prevention and treatment of transplantation immune reaction in clinic cord blood transplantation.

Key wordsHematopoietic stem/progenitor cellGene transferAntisense RNAMHC-Ⅱ gene

研究已知供受体HLA不完全相合脐血细胞移植可引起明显的移植免疫反应(免疫排斥反应和移植物抗宿主反应)。国内外研究资料证实造血细胞MHC-Ⅱ类抗原基因(HLA-DR)的成熟表达是引起移植免疫反应的关键所在^［1］。研究表明HLA-DR抗原为膜糖蛋白，由α、β链构成，其中组成β链的HLA-DRB基因对HLA-DR抗原的表达和稳定起重要作用^［2］。反义RNA可特异阻断目的基因的表达，目前已广泛应用于肿瘤、病毒的基因治疗^［3］。而运用反义RNA技术下调脐造血细胞HLA-DR的表达的研究少见报道。本文应用逆转录病毒介导的反义RNA导入造血干细胞特异阻抑HLA-DR抗原的表达，为临床进行造血干细胞移植时降低移植免疫反应的发生及克服组织相容性障碍提供新的思路和理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种和质粒pcDV1质粒含编码人HLA-DRB1(DR-B0101，45.1DR-β008)cDNA的全部序列由美国NIH的Long博士惠赠，逆转录病毒载体pZIP-neoSV(x)由本校免疫教研室王斌教授惠赠，宿主菌JM109由中山大学罗进贤教授提供。

1.1.2酶和试剂工具酶购自BRL公司，琼脂糖、低溶点琼脂糖购自Promega公司。rhEPO GM-CSF、IL-3购于GLBCO公司，抗CD34单抗、抗HLA-DR单抗购于DAKO公司，设计引物Ⅰ：5-GAATGGAGATTGGACCTTCC-3，引物Ⅱ：5-CCAAGCCGTTGACGTCTTTT-3(扩增产物为407 bp)，由中科院上海细胞生物所根据DR-B1基因序列设计合成含第二外显子的HLA-DRB1基因特异引物。

1.1.3仪器流式细胞仪(FACS)型号EpICS ELITE，美国Coulter公司产品，Mini MACS为德国Miltenyi Biotec公司产品。

1.2方法

1.2.1逆转录病毒重组体导入包装细胞和病毒上清制备pZIP-neoSV(x)为带有neo基因的逆转录病毒载体，将HLA-DRB1基因cDNA片段反向插入载体BamHI单酶切点，经扩增、抽提、酶切鉴定^［4］。用脂质体法将反义RNA重组体导入到PA317细胞，通过含G418 300 μg/ml培养液选择筛选，经4 w筛选获得抗性克隆，取分泌逆转录病毒的传代培养上清感染NIH3T3细胞，进行病毒滴度的测定^［5］。

1.2.2脐血CD34⁺细胞的分离、病毒上清感染脐血(血清型DR1，10)CD34⁺造血干/祖细胞分离采用免疫磁珠法，先分离单个核细胞，以IMDM调整细胞浓度，洗涤后加磁珠标记的单抗于10℃，孵育15 min，过Mini MACS细胞分离柱，脱离磁场，加压洗脱结合的阳性细胞，取适量细胞作FACS分析纯度。

按文献［6］方法进行。取2×10⁵ ml^-1 CD34⁺细胞种入培养瓶中，加IMDM培养液含20% FCS和EPO(1 U/ml,GLBCO),SCF(50 ng/ml,GLBCO),IL-3(200 U/ml,GLBCO) ，GM-CSF(200 U/ml,GLBCO)37℃,5% CO₂ 40 h后半量换液，加适量病毒上清和8 μg/ml Polyprene(Sigma，美国)，加含20%FCS IMDM和同上细胞因子培养48 h后，加G418使终浓度达300 μg/ml。48 h后分瓶，补加含G418 300 μg/ml新培养液和同上细胞因子培养7～14 d，筛选抗G418抗性集落，收集悬浮细胞接种于甲基纤维素半固体培养基扩增培养。对照组用IMDM代替病毒上清。

1.2.3造血祖细胞CFU-GM的检测CFU-GM体外培养体系^［7］，在IMDM体系中含甲基纤维素0.5%，FBS 30%，二巯基乙醇5×10^-5 mol/L，脐血CD34⁺细胞(2×10³ ml^-1)，加SCF+IL-3+EPO，加同上浓度的G418，加IMDM至总体积2 ml，混匀后加入到6孔培养板内，置37℃，5% CO₂培养14 d后计数集落数。经瑞氏姬姆萨染色证实为粒单系细胞。

1.2.4PCR检测脐血CD34⁺细胞反义RNA重组体从甲基纤维素半固体培养基中挑取单个克隆，加适量PBS沸水煮5 min，加入100 μg/ml蛋白酶K，20 μl样本加入PCR缓冲液，各引物50 pmol,4×dNTP 200 μmol/L,Taq酶约2 U，至终体积60 μl。加引物进行PCR扩增，反应参数为94℃ 1 min，45℃ 1 min,72℃ 2 min，35个循环，取20 μl的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.5FACS测定脐造血细胞HLA-DR抗原阳性细胞率体外培养已导入反义RNA的脐血干细胞7 d、14 d，用PBS洗2次后，计数按2×10⁶ ml^-1分别加入荧光单抗(抗HLA-DR细胞的单抗)，用PBS稀释，4℃ 30 min，用0.05% Tween 20 PBS洗涤后离心，加戊二醛至浓度0.05%，固定后FACS SCan测定。测定前细胞离心1 200 r/min，6 min,PBS洗涤上机测定。未导入反义RNA空载体逆病毒质粒的脐血细胞作对照。

2结果

2.1反义RNA重组体导入PA317细胞和病毒滴度重组质粒经脂质体转染PA317细胞后，在含300 μg/ml G418的选择性培养基10 d后，大量细胞被杀死，仅见散在的抗G418细胞团，3～4 w后逐渐形成肉眼可见的细胞克隆，见图1。经NIH3T3细胞测定病毒滴度为1×10⁵ CFU/ml。

图1分泌逆转录病毒pZIP/HLA-DR的抗G418细胞克隆

Fig.1The G418-resistant clone capable of secreting recombinant retrovirus2.2MACS分离脐血CD34⁺细胞以Ficoll密度梯度离心分离脐血单个核细胞，再以Mini MACS免疫磁珠系统进一步纯化，用FACS分析其纯度，CD34⁺脐血细胞比例高达85.0%～90.0%，见图2。

图2<