中国图书分类号R371.3

摘要目的：为揭示C5a和C5aR对肾小球内皮细胞(GVEC)-中性粒细胞(PMN)粘附的影响及其影响程度。方法：采用免疫组化胶体金银染色检测C5aR在人GVEC上的表达，并用微管吸吮技术定量测定了经C5a诱导后，GVEC和PMN细胞对间的粘附力，同时通过测定粘附的PMN中髓过氧化物酶(MPO)含量变化，观察不同剂量C5a对粘附的影响。结果：发现GVEC上分布C5aR，经2 000 ng/ml C5a刺激，GVEC-PMN间粘附力(Fa)达0.014 dyn，相对粘附应力(S1)为1 720.0 dyn/cm²，与对照组Fa(0.001 dyn)和S1(339.9 dyn/cm²)均有非常显著差异(P＜0.01)。MPO测定结果表明GVEC-PMN粘附的发生依赖于C5a剂量。结论：从生物力学角度直接定量阐明了C5a-C5aR对GVEC-PMN粘附行为的重要影响。

The effect of C5a on properties of adhesion between granulocytes and glomerulus vascular endothelial cells

QI Jie,ZHU Xi-Hua.

Department of Immunology,the Third Military Medical University,Chongqing 400038

AbstractObjective：To reveal whether C5a and C5aR affect the adhesion between human glomerulus vascular endothelial cells(GVEC) and granulocytes for determining.Methods：Immunogolden-sliver staining the expression of C5aR on GVEC,micropipette aspiration technique quantitatively studying the degree of the adhesion between GVEC and PMN and by measuring the change of amount of myeloperoxidase(MPO) in adherent PMN for analysing the dose of C5a which made the adhesion.Results：C5aR was expressed on human GVEC,when treating with 2 000 ng/ml C5a,the adhesive forces (Fa) and relative adhesion stress(S1) respectively reach 0.014 dyn and 1 720.0 dyn/cm²,which had much markedly difference compared with that in controls(Fa=0.001 dyn,S1=339.9 dyn/cm²).The adhesion between GVEC and PMN was enhanced in a C5a dose dependent manner.Conclusion：The data strongly directly suggested that C5a plays a key role in the adhesion between GVEC and PMN.

Key wordsC5aC5a receptorGlomerulus vascular endothelial cellCell adhesionMicropipette aspiration technique

C5a作为体内重要的炎症介质和过敏毒素通过与靶细胞上的C5aR相互作用参与并介导了多种疾病的病理进程^［1，2］。血管内皮细胞在炎症病变中最早受到损伤，已报道脐静脉内皮细胞，肺血管内皮细胞上分布C5aR，C5aR在肾小球内皮细胞(GVEC)上的分布还未见报道。本研究在发现GVEC表达C5aR的基 础上应用微管吸吮技术直接定量评价了 C5a和C5aR在 GVEC-PMN 粘附行为中的作用。

1材料与方法

1.1主要材料人重组C5a 和金标记蛋白A (Sig-ma); C5aR单抗(S5/1), Serotec产品。

1.2GVEC的分离和培养剪取胎肾皮质，收集滤网中研碎的组织颗粒，经0.05%胶原酶消化，离心收集细胞，于M199完全培养液中进行常规细胞培养并鉴定。

1.3IGSS检测参照常规免疫组化胶体金银染色（IGSS）方法进行^［3］。C5aR 单抗4℃孵育过夜。

1.4PMN的MPO活性分别用含5、10、1 000、2 000 ng/ml C5a的M199悬浮粒细胞，加入GVEC培养皿中，以不含C5a的粒细胞悬液为对照组，每组4个培养皿，于37℃ CO₂孵箱中反应1 h。洗去未粘附的PMN，加入0.5 ml MPO保护液，刮下GVEC，并测定每组粘附的PMN中MPO活性^［4］。

1.5GVEC和PMN粘附的力学测定将GVEC接种于3个特制的园型小室,细胞融合后分别加入200 μl 含1 000和2 000 ng/ml C5a的粒细胞悬液，以等量不含C5a的粒细胞小室作对照，CO₂孵箱中反应1 h， M199洗去未粘附的粒细胞，于微管吸吮仪上测定微管刚能拉脱GVEC上PMN时所需的临界负压值即阈值ΔP，每组连续测定5对细胞，以粘附力（Fa）和相对粘附应力（S1）为定量指标^［5］。Fa=ΔP*π*R²p (单位：10^-4 dyn)，S1=ΔP*(Rp/Rc)² (单位：dyn/cm²)，其中Rp为微管尖端半径，Rc为PMN半径。

1.6统计分析t检验，结果以±s表示。

2结果

2.1GVEC上C5aR的分布IGSS检测结果如图1。镜下GVEC上有散在分布，均匀大小的黑色银颗粒，表明GVEC上分布C5aR。

2.2MPO活性图2显示除5和100 ng/ml C5a刺激组间无差异外, 5 ng/ml 组与对照组有显著性差异(P＜0.05), 其余各组间均有非常显著性差异(P＜0.01)，表明MPO活性随着C5a刺激浓度的增加而递增。

2.3PMN-GVEC间的粘附力测定结果如图3。 当C5a刺激浓度达2 000 ng/ml时,Fa和S1与对照组间均有非常显著性差异(P＜0.01), 表明PMN与GVEC间Fa和S1受C5a刺激浓度影响,当C5a刺激浓度达2 000 ng/ml时,Fa和S1均显著增加。

图1IGSS检测GVEC上的C5aR

Fig.1C5aR on GVEC with immunogold-sliver staining(IGSS)

Note:A.The black sliver grain on GVEC treated with C5aR McAb(×1 000)；B.The GVEC without C5aR McAb treat

图2C5a刺激1 h后, GVEC培养皿中的MPO活性变化

Fig.2The activation of MPO in PMN after C5a treat with 1 h

Note:*P＜0.05；**P＜0.01 vs control

图3C5a刺激1 h后 PMN与 GVEC间的粘附力学测定

Fig.3The adhesion forces between PMN and GVEC after C5a treat with 1 h

Note:A.The change of adhesion forces (Fa)，**P＜0.01，VS control;B.The change of relative adhesion stress (S1)；*P＜0.05，VS 1 000 ng/ml，++P＜0.01 vs control

3讨论

3.1C5aR在内皮细胞上的分布除髓样细胞外，多种组织细胞如脐静脉内皮细胞、肝实质细胞、小胶质细胞和肺泡上皮细胞等均表达C5aR, 但C5aR在同种细胞上的分布存在异质性，如不同器官组织中肥大细胞C5aR的表达，在肺、子宫和扁桃体中的肥大细胞不表达C5aR^［6］。除脐静脉内皮细胞和肺血管内皮细胞表达C5aR外, 本文首次还证实在肾小球内皮细胞上也分布C5aR，并参与了细胞间的粘附。其它组织中内皮细胞上C5aR的分布是否存在异质性还有待深入研究。

3.2PMN-GVEC的粘附及粘附力本研究从不同角度观察了C5a对PMN-GVEC粘附的影响，用微管吸吮技术(MAT)测定C5a对单个细胞对间粘附力的影响，同时通过测定PMN中MPO的活性观察C5a对细胞整体粘附的影响。结果表明C5a不仅可显著引起PMN-GVEC粘附的发生，还可促进粘附细胞间粘附力的增加。由于粘附行为是由各对粘附分子提供的较小粘附力来共同增加的效应总和，因此用细胞对间的粘附力来定量评价粘附行为，较传统粘附率更能直接客观地反映C5a对粘附的影响程度。

目前已发现C5a通过C5aR上调脐静脉内皮细胞表达P-选择素, PMN表达CD11b/CD18，导致PMN-VEC的粘附率增加，细胞变形，内皮细胞损伤^［7，8］。除C5a外还有许多炎症介质、细胞因子引起PMN和内皮细胞的粘附，因此了解C5a在粘附行为中的作用程度，对防治和治疗相关性炎症疾病具有重要意义。

C5a对中性粒细胞和肾小球内皮细胞粘附行为的影响国家自然科学基金资助项目(39770315)

齐洁联系人及现地址：中科院上海细胞生物学研究所马普青年二组，上海200031,e-mail:jieqi @ server.shcnc.ac.cn

作者简介：齐洁，女，分子免疫学博士；

朱锡华，男，免疫学教授，博士生导师，主要研究分子免疫

4参考文献

1Vogt W. Anaphylatoxins: Possible roles in disease. Complement，198