摘要:目的构建VH基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库，并筛选抗HFRS病毒NP抗原的噬菌体抗体。方法采用随机引物PCR法扩增抗HFRS病毒mAb1A8的VH基因，并与1A8VL基因共同克隆入噬菌粒表达载体pHEN1后，构建VH基因随机CDR3ScFv基因库。继用辅噬菌体VCSM13超感染后得到噬菌体抗体库，然后用HFRS病毒抗原进行筛选。随机挑取筛选的菌落超感染，用夹心ELISA检测超感染上清。结果获得库容量约为107噬菌体抗体库。夹心ELISA的结果表明，筛选出的噬菌体抗体可与HFRS病毒NP抗原特异性结合。结论成功地构建了库容量较高的ScFv噬菌体抗体库，并获得 可与HFRS病毒NP抗原结合的噬菌体抗体。

中图号：Q782文献标识码：A

文章编号：1007－8738(2000)02－0171－03

Constructionand screening of ScFv phage repertoire with random CDR3 of VH gene

YAN YanBAI Wen- taoXU Zhi- kaiLUO WenHANG Fang- lin WU Xing- anLIU YongWANG Hai- tao

（Department of Microbiology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China ）

Abstract: Aim To construct ScFv phage repertoire with random CDR3 of VH gene and to screen phage antibodies against NP antigen of HFRS virus. Methods The VH gene of mAb 1A8 against HFRS virus was amplified with random oligonucleotide primers. The ScFv gene repertoire was constructed by cloning the amplified VH gene into phagemid expression vector pHEN1 containing VL gene of mAb 1A8. The phage repertoire was obtained by superinfection with helper phage VCSM13 and then screened using NP antigen of HFRS virus. Subsequent clones were selected randomly and the phagemid were rescued with VCSM13 helper phage. The supernatants harvested were detected by indirect sandwich ELISA. Results The ScFv phage repertoire with capacity of 107 was obtained. The results of indirect sandwich ELISA indicated that screened phage antibodies could react specifically with the NP antigens. Conclusion ScFv phage repertoire with higher capacity is constructed successfully and phage antibodies with binding activities to NP antigen are obtained.

Keywords: single chain Fv; phage repertoire; HFRSV; affinity; maturation

通过体外亲和力成熟技术提高抗体亲和力，主要有两种方法:一种是突变抗体的互补决定区（CDR）基因，另一种是链更替(chain shuffling)。突变抗体可变区基因的方法主要有:①随机引

物PCR突变；②Error-PronePCR突变；③应用对外源基因产生高突变的大肠杆菌菌株进行突变^[1－6]。我们采用随机引物PCR突变的方法，突变抗HFRS病毒小鼠单克隆抗体(mAb）1A8重链可变区(V_H

）基因的互补决定区3(CDR3），构建VH基因随机CDR3单链抗体(ScFv)噬菌体抗体库并进行筛选，以为获得具有提高结合活性的抗 体基因奠定基础。

1材料和方法

1.1材料ScFv的表达载体pHEN1，由张劲一博士惠赠。1A8pHEN1为本室将抗HFRS病毒mAb1A8ScFv基因克隆入表达载体pHEN1;1A8V_HSfi为mAb1A8的V_H基因克隆入pUC18；1A8V_HXho为1A8V_HSfi改建。用EcoRI和BstEII酶切、补平、连接后，所得克隆无V_H基因J区的BstEII酶切位点。HuV_H/pUC为一人抗体V_H基因克隆入1A8V_HSfi。以上载体除pHEN1外，均为本室克隆和构建^[8,9]。菌种采使用E.coliXL1-Blue。

1.2方法

1.2.1表达载体的构建以质粒1A8pHEN1为模板，用引物Mo5和ScF进行PCR扩增。引物均为本室设计并由宝生物公司合成，序列 如下：

PCR的反应条件为：100μL体积中，含引物各50pmol，94.5℃60s，50℃60s，72℃60s，共35个循环。将扩增产物用NcoI和XhoI酶切后，克隆入相应酶切的表达载体pHEN1。酶切鉴定筛选出的阳性克隆，命名为LVL/pHEN1。用NcoI和BstEII酶切HuVH/pUC，回收约360bp的人VH基因，克隆入相应酶切的LVL/pHEN1中，酶切鉴定筛选出的阳性克隆，命名为HuV_H-LVL/pHEN1。

1.2.2V_H基因的扩增和噬菌体抗体库的构建根据抗体的基因结构设计扩增VH基因的随机引物，VHFRam6含有可编码6个随机 的碱基，其序列如下:

以微量1A8V_HXho质粒为模板，进行PCR扩增（扩增条件同上）。将PCR产物用NcoI和BstEII酶切。回收纯化后，取约5μg的片段与约1μg的相应酶切的HuV_H－LVL/pHEN1连接，用电穿孔法转化E.coliXL1－Blue，提取质粒，酶切鉴定确定克隆的效率。用辅噬菌体VCSM13(效价约10¹⁵pfu/L)超感染，所得上清即为噬菌体抗体库。

1.2.3噬菌体抗体库的筛选及初步鉴定用mAb1A8的腹水（1∶1000）包被ELISA板，经30g/L脱脂奶粉封闭后，依次加入HFRS病毒核蛋白（NP）抗原（购于兰州生物制品研究所）和噬菌体抗体库上清孵育后，用100μL0.1mol/LHCl－甘氨酸(pH2.2)洗脱，并以6μL2mol/LTris中和。于每100μL洗脱液中，加入200μL新鲜的XL1－Blue，并按一定稀释度涂布于90mm氨苄平板计算菌落数。其余加入2×YT培养液至10mL，置37℃摇床培养过夜。重复上述筛选过程3次，随机挑取筛选出的菌落，用辅噬菌体VCSM13超感染。然后用ELISA间接夹心法检测超感染的上清。ELISA中所用的H RP-antiM13为Pharmacia公司产品。

2结果

2.1表达载体的构建用引物Mo5和ScF扩增表达载体1A8pHEN1，所得基因为V_HJ-linker-V_L。V_HJ为V_H基因中J区的部分序列，linker编码的氨基酸为(Gly₄Ser)₃。将扩增产物用NcoI和XhoI 酶切后，克隆入表达载体pHEN1。用HindIII和XhoI酶切鉴定，可切出约500bp的片段（HindIII和NcoI间有108bp的前导肽基因），结果见图1中的F。将VH基因用NcoI和BstEII直接克隆入该载体的相应位点，即可构建ScFv基因的表达载体。将人V_H基因克隆入上述表达载体后，获得的HuV_H－LVL/pHEN1，可增加NcoI和BstEII间的距离，有利于提高克隆的效率。克隆的人V_H基因与HFRS病毒抗原 无结合活性。

2.2噬菌体抗体库的构建将随机CDR3引物扩增的mAb1A8V_H基因克隆入上述表达载体，转化后总菌落数约为1.4×10⁷，不必挑取单菌落，即可直接提取质粒进行酶切鉴定（结果见图1，载体的部分序列见图2）。因mAb1A8VH基因含有BamHI， HindIII和XhoI的酶切位点（序列见参考文献[8]

），因此，将无插入片段的克隆用HindIII和BamH＜

I＞I酶切可切出约1.5kb的片段；含有插入片段的克隆可切出 约1.2kb的片段(图1中的B)。应用HindIII和XhoI鉴定不含插入片段和含插入片段的克隆，可分别切出约830bp和520bp的片段(图1中的D)；用NcoI和NotI只可切出约740bp的ScFv基因(图1中的C)。从上述结果可见，含有插入片段的克隆切出的片段，较不含插入片段的克隆切出的片段量大得多，估 计克隆效率至少达80％，因此库容量＞10⁷。

图1ScFv基因抗体库的酶切鉴定

Fig1Identification of ScFv gene repertoire

with restriction en-zyme digestion

A:DNA marker λ NDA EcoR I＋Hind III;

B:Digestion with Hind Ⅲ＋BamH I;C:Digestion with

Nco I＋Not I;D:Digestion with Hind Ⅲ＋Xho I;E:

DNA marker pGEM7zf Hae III;F:Digestion of recombinant

phagemid LVL/PHEN1 with Hind III＋BamH I.

图2噬菌粒表达载体pHEN1，LVL/pHEN1和

ScFv基因抗体库的部分 序列及克隆位点

Fig2Partial sequence and cloning sites of pHEN1,