摘要：目的克隆人白血病细胞凋亡相关新基因TFAR15的小鼠同源序列，并比较其在不同种属间的序列同源性。方法利用EST(expressedsequencetag)拼排、RT-PCR、DNA序列测定

和计算机分析技术，对小鼠TFAR15进行研究。结果首次成功地进行了小鼠TFAR15全长cDNA的克隆和序列分析，发现小鼠TFAR15与小鼠其它cDNA没有明显的同源性，因此提交GenBank并被收录，登录号为AF159368。小鼠TFAR1 5和人FAR15在核苷酸水平上有92.3％的同源性，在氨基酸水平上有高达98.6％的同源性；同时发现小鼠TFAR15在氨基酸水平上与线虫C14A4.11蛋白质有38％的同源性。功能区分析发现，小鼠TFAR15cDNA序列含编码212个氨基酸的开放读码框架，有2个可能的N-糖基化位点，3个可能的caseinkinaseII磷酸化位点，4个可能的PKC磷酸化位点，并且可能是一种胞浆蛋白(cytoplasmicprotein)。结论小鼠TFAR15是进化上高度保守的新基因，可 能具有重要的功能。

中图号：Q78

文献标识码：A

文章编号：1007－8738(2000)02－0097－04

cDNA cloning and sequencing of a novel mouse apoptosis related gene TFAR15

SUN Rong- hua,HUANG Jia-qiang,HAN Wen- ling,WANG Ying,MA Da- long

（Department of Immunology,Beijing Medical University,Bei jing 100083, china）

Abstract:Aim To clone a mouse homologous sequence of a human novel gene TFAR15(TF- 1 cell apoptosis relatedgene- 15) and to analyze their sequence homology among the different species. Methods The EST(expressed sequencetag) sequence alignment method, RT- PCR, DNA sequencing, and computer analysis were used for the cDNA cloningof mouse TFAR15. Results The full length of mouse TFAR15 cDNA was successfully cloned and sequenced. There was92.3％ homology between mouse and human TFAR15 at the nucleotide level and 98.6％ homology at amino acidlevel. It contained an open reading frame encoding 212 amino acids, two potential N- glycosylation sites, threecasein kinase II phosphorylation sites, and four potential PKC phosphorylation sites. It was possible that mouseTFAR15 protein was a cytoplasmic protein. Conclusion Mouse TFAR15 was highly homologous with human TFAR15.Further experiment was needed to confirm its biological activities.

Keywords: TFAR15; EST alignment; apoptosis

细胞凋亡，是生理条件下的细胞程序化死亡过程，在胚胎发育、组织发生、造血细胞增殖与分化等许多方面起着十分重要的作用。细胞凋亡是多种分子参与的复杂的细胞内信号传导过程^〔1〕。在这一过种中，有些基因被诱导表达或表达水平升高，而有些基因表达水平降低甚至表达完全抑制^〔2〕。TFAR15是细胞因子撤除后诱导TF-1细胞凋亡过程中，克隆到的表达增加的一个新基因^〔3〕，其生物学功能还有待进一步的研究。初步研究表明，其对某些细胞具有抑制凋亡的效应^〔4〕。为进一步了解不同种属间TFAR15序列的同源性，并为小鼠体内TFAR15功能的研究做准备，我们借助EST(expr essedsequencetag)数据库等，成功地进行了小鼠TFAR15全长cDN A的克隆和序列分析。

1材料和方法

1.1材料Swiss小鼠胚胎NIH3T3成纤维细胞株，由本室常规传代培养。Trizol total RNA Isolation System试剂盒和Super Script Preamplification System试剂盒，购自Gibco公司，pGEM-TEasy载体购自Promega公司。

1.2方法在NCBIGenBank数据库中，利用Blastn检索dbest数据库。将EST数据库检索到的与人TFAR15具有高度同源性的小鼠EST序列拼排，每1个碱基至少经过两条以上EST序列验证，拼排成小鼠TFAR15序列。根据拼排的小鼠TFAR15相对保守序列区合成PCR引物：上游引物从第75位碱基开始，序列为：5′-AAGGTGGGA-AGTGAAGTC-3′；下游引物针对的是mTFAR15基因序列中的1087～1029位碱基，序列为：5′-TGCAG-CATATCGCTTTCAAGTT-3′。利用Trizol total RNA Isolation System试剂盒，提取NIH3T3细胞总RNA，再经Super Script Preamplification System反转录合成cDNA第1链，制备NIH3T3cDNA文库，进行PCR扩增。扩增产物用AT法克隆到pGEM-TEasy载体中，构建pGEM-TmTFAR15克隆，用于测序。由大连宝生物工程公司利用ABI公司的377全自动DNA测序仪，进行DNA序列分析。用ORNL的Grail软件，ExPASy的AACompIdent，Prosite和SignalP软件，GenomNet的Psort，Motif软件及Fickett法，进行mTFAR15核苷酸及蛋白序列的计算机分析。

2结果

2.1GenBank数据库检索和EST序列拼排根据公布的人TFAR15 cDNA序列，经国际互联网进入美国GenBank。利用Blastn检索nr数据库，未发现小鼠的TFAR15同源序列；再经EST数据库检索，发现至少有72个长度不一的与人TFAR15高度同源的小鼠EST序列。经过对其中的14个互相重叠的EST序列(GenBank登记号分别为：AI433690，AA915016，AA286381，AI644171，AA168243，AA606706，AU020738，A915016，AA833454，AA546871，AA959814，AA599041，AA848801，AA599041)进行计算机拼排，推断出小鼠全长TFA-R15cDNA序列(图1)。该序列共有1290个碱基，有1个编码212个氨基酸的完整开放读 码框架，polyA尾巴和最常见的加尾信号AATAAA。通过计算机同源性分析证明，人与鼠的cDNA序列间有92.3％的同源性，编码区的同源性高达 94.3％。

图1拼排的mTFAR15全长cDNA及其编码序列(下画线表示引 物序列)

Fig1CompletecDNAsequenceofalignedmouseTFAR15anditscoding sequence

(theunderlineindicatedtheprimersequences)

2.2PCR扩增和序列测定根据拼排的mTFAR15全长序列，设计PCR引物，以小鼠NIH3T3细胞cDNA文库为模板进行扩增。扩增产物约为1200bp，经酶切鉴定与预期结果一致(图2)。将PCR扩增产物克隆到pGEM-TEasy载体中，进行序列分析。经过对pGEMT-TFAR15质粒进行序列分析，获得小鼠TFAR15全长核苷酸序列，与预期序列完全一致。通过Gen BankBankit功能进行登记，登录号为AF159368。

图2pGEMT-mTFAR15的酶切鉴定

Fig2 Restriction enzymes analysis of pGEMT-mTFAR15

1:mTFAR15 PCR product;2:pGEMT-mTFAR15/ScaI;3:pGEMT-mTFAR15/Pvu II；

4:pGEMT-mTFAR15/PstI;5:pGEMT-mTFAR15/NcoI;6:pGEM DNA marker

(2645,1605,1198,676,517,460,396,350,222 bp);7:pGEMT-mTFAR15/EcoR I；

8:pGEMT-mTFAR15.Corresponding enzyme sites of EcoR I,

Nco I,Pst I and Pvu II on the sepuence of mTFAR15 PCR product

are:452；204；277 and 543；410. No Sca I site.

2.3mTFAR15的氨基酸序列分析用ORNL的Grail软件，ExPASy的AACompIdent，Prosite和SignalP软件，GenomNet的Psort，Motif软件和Fickett法，进行mTFAR15核苷酸及蛋白序列的计算机分析。mTFAR15全长cDNA可能的最大读码框架为第198～833位碱基，编码212个氨基酸，与人的TFAR15蛋白有98.6％的同源性。mTFAR15蛋白的pI=7.80，分子量为24772.65，有两个可能的N-糖基化位点(分别在第37，75位氨基酸)，3个可能的Casein kinaseII磷酸化位点(分别在第4，130和173位氨基酸)，4个可能的PKC磷酸化位点(分别在第43，130，177和207位氨基酸)。无N-端信号肽序列(N-terminal signal sequence)；C端无核定位信号(NLS)及内质网滞留序列(ER retention motif)。虽然有两个内质网滞留序列信号(XXRR-like motif in the N-terminus:RMTM及KKXX-like motif in the C-terminus:FKTV)，但不能确定是否为ER膜蛋白，其最大可能是一种胞浆蛋白(cytoplasmic-protein)。

2.4mTFAR15的氨基酸序列比较将拼排得到的mTFAR15全长cDNA序列，经国际互联网进入美国GenBank。利用Blastp检索nr数据库，发现小鼠TFAR15与人TFAR15在氨基酸水平上的同源性高达98.6％；与线虫C14A4.11有30％的同源性，相似氨基酸达68％。比较的结果如图3所示(上排为小鼠TFAR15 ，下排为线虫C14A4.11)。

图3鼠TFAR15与线虫C14A4.11的氨基酸序列比较

Fig.3Amino acid sequence comparison between

mouse TFAR15 and Celegans C14A4.11

3讨论

我们在TF-1细胞去因子<