摘要:目的制备用地高辛（digoxigenin，Dig）标记的血小板T细胞活化抗原1（plateletandTcellactivationantigen1,PTA1）cRNA探针。方法构建重组质粒pGEM-3ZF(＋)-PTA1，并做序列分析证实PTA1基因的插入方向正确后，用EcoRI消化得到线性DNA片段，再用SP6RNA聚合酶转录合成带有Dig标记的高比活度的单链cRNA探针。结果经斑点杂交证实，该探针敏感性高、特异性强。结论地高辛标记PTA1cRNA探针的制备，为进一步研究PTA1mRN

A在组织、细胞的表达和分布提供了有效的工具。

中图号：R392.31文献标识码：A

文章编号:1007－8738（2000）02－0113－03

Preparation and identification of digoxigenin labeled platelet and T cell activation antigen 1 cRNA probe

CHEN Li-huaOU- YANG Wei- mingZHU YongJIN Bo- quan

（Department of Immunology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033， Shaanxi Province， China）

Abstract:Aim To construct digoxigenin labeled platelet and T cell activation antigen 1 cRNA probe. Methods Arecombinant plasmid pGEM- 3ZF(＋)- PTA1 was constructed by molecular cloning techniques for the preparationof digoxigenin labeled PTA1cRNA probe. Sequencing showed that recombinant plasmid pGEM- 3ZF(＋)- PTA1did contain the DNA fragment of PTA1 gene and insertion direction was correct. We used the plasmid as a template tosynthesize the digoxigenin labeled RNA probes by means of transcription procedure in the presence of SP6 RNApolymerase. Results The probe was identified by dot hybridization with purple- blue presentation on the positive

lableled sites. Conclusion Digoxigenin labeled PTA1 cRNA probe could be used for further research on the distribution, expression and function of PTA1 in the cells and tissues.

Keywords： platelet and T cell activation antigen 1; recombinant plasmid; Dig- cRNA probe； dot hybridization

血小板T细胞活化抗原1(PTA1)是1997年基因克隆的新分子，属于免疫球蛋白超家族成员，具有重要的生物学功能^[1－5]。PTA1分子主要分布于巨核／血小板谱系、活化T细胞、NK细胞，以及某些T白血病细胞^[6]。但PTA1mRNA的表达及其与PTA1分子表达的相关性研究至今尚未见报道。为全面系统地了解PTA1mRNA在组织和细胞的表达特点，及其与PTA1分子表达的相关性，我们制备了PTA1cRNA探针并对其进行了鉴定。

1材料和方法

1.1材料质粒pGEM-3ZF(＋)购自华美生物工程公司。pEF-BOS-PTA1为本室冻存。引物由中国科学院微生物研究所合成，序列为：5′-GCA AGC TTA TGG ATT ATC CTA CTT TAC-3′和5′-GCG GAT CCT TAG GTA TAT TGG TTA TCG-3′。SmaI购自Promega公司。BamHI和HindIII购自Gibco公司。T4连接酶购自华美公司。DNA胶回收kit购自Clontech公司。质粒小量提取kit购自Promega公司。Dig标记cRNA探针的标记试剂盒，为Boehringer Mannheim公司产品。

1.2方法

1.2.1重组质粒pGEM-3ZF(＋)－PTA1的构建以pEF-BOS-PTA1为模板，通过PCR扩增PTA1cDNA胞膜外区。扩增参数为：94℃ 4min，94℃ 45s,55℃ 50s，72℃ 1s，共30个循环；72℃ 延伸10min。PCR产物经试剂盒回收753bp片段后，用BamHI酶切。质粒pGEM-3ZF(＋)用SmaI和BamHI在37℃消化2h。将酶切后的DNA片段进行10g/L琼脂糖凝胶电泳（电压50V，1h）。切下3.2kb的片段，用DNA胶回收Kit纯化。将纯化后的3.2kb片 段与BamHI酶切的PCR产物按等摩尔浓度混合，加入T4连接酶，在16℃条件下进行连接反应16h。以CaCl₂法，将大肠杆菌DH5α制备成感受态细胞，加入经连接反应后的混合物，以热休克法使质粒DNA进入感受态细胞。将此细胞悬浮培养在LB培养液中，37℃ 1h，然后铺在含有AMP的LB培养基上，转化后挑选出重组克隆。采用质粒小量提取kit提取 质粒后，分别用HindIII和EcoRI酶切鉴定，并测序加以证实。

1.2.2PTA1cRNA探针的制备用质粒小量提取kit提取重组质粒pGEM-3ZF(＋)－PTA1后，以EcoRI酶切回收大的片段，获得线性pGEM-3ZF(＋)－PTA1，再经酚、氯仿抽提后，回收沉淀作为模板。在绝对无RNA酶的条件下，用地高辛精cRNA标记试剂盒进行反转录标记反应（总体积为20μL，37℃ 2h）。反应体系中含有：10mmol/LDTT，RNA酶抑制剂20U，ATP，CTP和GTP各1mmol/L，0.65mmol/LUTP及0.35mmol/L地高辛精标记的UTP，1.0μg的PTA1线性DNA模板和30U的SP6RNA聚合酶。然后，用pH8.0的EDTA20mmol/L终止反应，加1/10体积的4mol/LLiCl和3倍体积的无水乙醇，于－70℃沉淀探针30min，再用750mL/L冷乙醇洗涤2次，最后溶解于DEPC水中。加入RNA酶抑制剂（1MU/L）后，分装于小Eppendorf管中，置－70℃贮 存。

1.2.3地高辛精标记cRNA探针的鉴定将含有目的序列的重组质粒pGEM-3ZF(＋)－PTA1和试剂盒中的对照质粒pSPT18-Neo加热变性，分别用DEPC水进行10倍系列稀释（1，0.1和0.01g/L），然后将稀释的质粒DNA按不同浓度梯度点于硝酸纤维素滤膜上。将膜置于80℃、2h以固定DNA。先进行预杂交（42℃摇动2h），然后在上述体系中，分别加入地高辛精标记的PTA1cRNA探针和试剂盒

中的地高辛精标记的NeocRNA探针（10μg/L）进行杂交（42℃摇动16h）。杂交后依次用2×SSC和0.1×SSC洗涤15min，再用缓冲液洗涤1次后，用30g/LBSA封闭。加AP标记的抗地高辛抗体（1∶5000）室温孵育3h，洗涤后，用NBT-BCIP室温避光显色20min。

2结果

2.1重组质粒pGEM-3ZF(＋)－PTA1的构建图1为重组质粒构建的示意图。重组质粒用HindIII和EcoRI进行双酶切鉴 定。用HindIII可切成两条带，其中1条为750bp左右；用EcoRI也可切成两条带，其中的小片段约为250bp，所获结果与酶切图谱相符（图2）。DNA序列测定证实，重组质粒中含有PTA 1胞膜外区基因片段，且插入方向正确。

图1重组质粒pGEM-3ZF(＋)-PTA1的构建

Fig1Construction of recombinant vector pGEM3ZF(＋)-PTA1

图2重组质粒pGEM－3ZF(＋)-PTA1的酶切鉴定

Fig2Identification of recombinant plasmid pGEM-3ZF(＋)－PTA1

by restriction enzyme digestion

1:λDNA/EcoRI,Hind III marker；2:pGEM-3ZF(＋)/ EcoRI;

3:pGEM-3ZF(＋)-PTA1/Hind III；4:PCR marker;5:pGEM-3ZF(＋)-PTA1/EcoRI.

2.2PTA1cRNA探针的制备重组质粒pGEM-3ZF(＋)-PTA1经EcoRI酶切后，用酚、氯仿抽提、乙醇沉淀回收，可得到线状PTA1模板DNA（图2）。上述线性模板DNA片段，用地高辛精cRNA标

记试剂盒进行cRNA探针体外转录和标记合成反应，得到的反应 产物即为探针，其长度经计算为507bp。

2.3斑点杂交将含有探针序列的重组质粒pGEM-3ZF(＋)－PTA1和试剂盒中的对照质粒pSPT18-Neo，分别与地高辛精标记的PTA1 cRNA探针和试剂盒中地高辛精标记的Neo cRNA探针（10μg/L）进行杂交，结果呈蓝紫色，颜色的深浅与稀释度成正比（图3）。交叉杂交：即将含有探针序列的重组质粒pGEM- 3ZF(＋)－PTA1和试剂盒中的对照质粒pSPT18-Neo，分别与试剂盒中地高辛精标记的NeocRNA探针和本实验所标记的地高辛精PTA1cRNA探针进行杂交，未见明显的蓝紫色(结果未显示)，说明标记探针具有良好的特异性。根据阳性对照估计，标记探针的总量约为10μg。

图3两种地高辛精标记的cRNA探针的斑点杂交

Fig3Dot blot hybridization of two Dig-labeled cRNA probes

3讨论

我们在构建重组质粒的基础上，用体外反转录法，制备了PTA1cRNA探针。斑点杂交结果显示，杂交阳性信号较强，证明本实验以地高辛精标记的PTA1cRNA探针敏感性高、特异性强。

已有许多实验结果表明，与DNA探针相比较，cRNA探针具有许多优点：如较易与组织中的mRNA杂交，效率约为DNA探针的10倍；RNA与RNA的杂交体稳定；杂交后可用RNA酶去除未杂交的cRNA探针，不易出现假阳性；cRNA探针为单链，杂交前不用高温变性。因此，使用cRNA探针可使实验具有更高的严谨性^[7]。与放射性标记的探针相比较，地高辛标记的探针对人体无害；不受半衰期限制；探针可长期保存^[