摘要：目的揭示膜结合的TNF-α前体(mTNF-α)与分泌型TNF-α(sTNF-α)生物学活性的不同。方法在克隆出mTNF-α基因的基础上,我们采用IL-2信号肽编码序列置换m-TNF-α前导肽编码序列,构建出只产生分泌型TNF-α的真核表达质粒pBK-sTNFm,并转染至NIH3T3细胞中。结果筛选出的阳性克隆细胞经Westernblot分析及活性测定显示,pBK-sTNFm转染细胞裂解液及培养上清，均可检出相对分子质量（Mr）17000的TNF-α,且上清具有sTNF-α活性,但细胞固定后其活性丧失。结论成功地构建了在真核细胞中只产生sTNF-α的表达质粒,并建立相应的表达细胞株。为比较两种类型的TNF-α的生物学活性及其作用机制奠定了基础。

中图号:Q78文献标识码：A

文章编号:1007－8738（2000）01－0006－09

Construction of eukaryotic expression vector and establishment of cell line solely producing human TNF-α in secretory form

HUANG Jia-qiang,BU Xia, SHI Xu, LI Zhuo-ya, GONG Fei-li

Department of Immunology, Tongji Medical University, Wuhan 430030, Hubei Province, China

Abstract: Aim To reveal the differences between membrame-bound TNF-α precusor(mTNF-α ) and secretory TNF-α (sTNF-α)in the bioactivities. Methods A recombinant TNF with only secretory form(pBK-sTNFm) was constructed in which the leader sequence of TNF-α was replaced by the DNA sequence coding the human IL-2 signal peptide and then transfected into NIH3T3 cells. Results G418-resistant colonies and their expression products were identified by bioassay and Western blot. TNF with Mr 17 000 could be demonstrated both in cell lysate and culture supernatants of the pBK-sTNFm transfected cells and only the supernatant displayed cytotoxicity. Conclusion A cell line only producing sTNF-α is successfully established, which also provides the basis for studying the biologic activity and its mechanism.

Keywords:secretory TNF; membrane－ bound TNF;signal peptide; gene transfer

TNF-α是一多效性细胞因子[1]。现已知,由233个氨基酸组成的TNF-α与典型的分泌型蛋白的合成及分泌机制不同[2,3]。TNF-αN端的含有由76个氨基酸组成的超常前导肽，在内质网中不被切除，而是首先通过其疏水氨基酸区将TNF－α前体“锚定”于胞膜表面,形成Mr为26000的膜结合型TNF-α(mTNF-α),进而通过TNF-α转换酶(TNF-α-converting enzyme,TACE)[4]裂解，产生由157个氨基酸组成的Mr17000的分泌型TNF(sTNF)，故TNF-α在体内可有两种形式存在。研究表明，两型TNF-α在生物学效应及其作用机制等方面各具特征[2－5]。为了能更好地分别研究两型TNF-α，我们构建了在真核细胞中只产生S-TNF-α的表达质粒，并建立相应的表达细胞株。

1材料和方法

1.1材料大肠杆菌XLI-BlueMEF和穿梭载体pBK-CMV，由翦必希博士惠赠。细胞株NIH3T3购自武汉大学中国典型物保藏中心;L929为本室保存。TRIzol试剂、Superscript逆转录试剂、T4DNA连接酶、限制性内切酶、G418、RPMI－1640和DMEM细胞培养基、小牛血清(Gibco)；质粒提取纯化试剂盒、DOTAP转染试剂(BoehringerMannhe-in，BRM)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Fluka)；抗hTNF－αmAbT4(北京邦定公司)。其它生化试剂均为进口或国产分析纯。

1.2方法

1.2.1M-TNFcDNA(mTNF)的克隆及测序〔6a〕以LPS（100μg/L）刺激人外周血单核细胞4h后，提取总RNA，并逆转录合成cDNA第1条链。以此链为模板，进行PCR扩增mTNF-α，反应条件为:94℃ 1 min，64℃ 1 min，再72℃ 1 min，循环28次；再72℃ 10 min。PCR产物经沉淀、BamHI/HindIII双酶切、低溶点琼脂糖凝胶电泳回收纯化，再与相应酶切后的质粒pBK-CMV定向连接。经转化、筛选及鉴定后，命名为pBK-mTNF。用双脱氧核苷酸末端终止法，对插入片段用373A型DNA荧光测序仪（ABI公司）进行自动测序分析。

图1sTNFm的构建与序列分析

Fig 1Construction and sequence analysis of sTNFm

1.2.2单纯分泌型TNF-α基因(sTNFm)的构建及测序采用基因重叠延伸拼接PCR法(genesplicingbyoverlappingextensionPCR，SOE-PCR)[7](图1)。提取ConA(20mg/L)刺激24h后的人外周血单个核细胞总RNA，以逆转录合成cDNA第1条链为模板。sTNFm扩增引物由一对外侧引物(P3和P2)和一对内重叠连接引物(P4和P5)组成。首先用P3和P4扩增基因片段A，PCR反应条件为：94℃30s，60℃50s，72℃30s，循环28次；再72℃5min。以测序验证后的pBK-mTNF为模板，以P5和P2扩增基因片段B，反应条件为:94℃4min，94℃1min，62℃1min，72℃1min，循环28次；再72℃10min。片段A，B经电泳回收纯化后，各取1μg混合作为模板，以上述一对外侧引物P3和P2进行PCR扩增，反应条件为:94℃1min，50℃2min，72℃3min，共25个循环。电泳回收纯化的PCR产物，按上述方法构建出sTNFm的真核表达质粒，命名为pBK-sTNFm并测序。

1.2.3细胞转染及筛选〔6b]用DOTAP试剂将pBK-mTNF、pBK-sTNFm及其对照pBK-CMV转入NIH3T3细胞，继续培养48h后，分别取部分细胞培养于8孔玻片(BRM)进行间接免疫荧光检测。其余细胞按1×105个/孔接种于24孔培养板内，加选择培养基。3wk后选择培养基逐渐减量，4wk后减至一半，并用有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆。

1.2.4克隆细胞株表达产物的鉴定表达产物生物活性的检测与筛选:采用MTT法。收集1×106转染细胞培养上清，检测上清(分泌型蛋白)对靶细胞L-929的细胞毒活性[8]。转染细胞用10mL/L多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，按效：靶比例10∶1加入L-929细胞，参照文献[5]检测膜结合型蛋白对靶细胞L-929的细胞毒活性。表达产物的Westernblot分析[6c]:收集1×106传代培养24h后的转染细胞及其培养上清（用Amicon浓缩器离心透析浓缩)，进行Westernblot分析。

2结果

2.1pBK-sTNFm的构建通过RT-PCR，从人单个核细胞中扩增出的片段A，含有IL-2和5′端添加的酶切位点及3′端连接的sTNF-α重叠序列，大小应为84bp，与电泳结果相符(图2)。片段B的电泳位置接近于515bp，与预计的长度(504bp)一致(图3)。以片段A和B为模板，进行SOE-PCR扩增sTNFm并构建pBK-sTNFm。酶切(图3)及测序分析(图1)证明，已成功地构建了s-TNF-α的真核表达质粒。

图2片段A基因扩增产物的(20g/L琼脂糖凝胶)电泳

Fig220g/L agarose gel electrophoresis of the PCR

amplified products of fragment A gene

1:PCR marker(SABC);2,3:PCR producs of fragment

A gene(84bp);4:PGEM marker(Promega).

图3重组质粒pBK－sTNFm的酶切鉴定

Fig3Identification of recombinant plasmid pBK－sTNFm by

restriction endonuclease digestion

1:PCR marker(SABC);2:PCR producs of fragment Bgene(504bp);3:PCR products by using pBK-mTNF as the template(551bp);4:pBK-sTNF/BamHI＋Hind Ⅲ(544bp,4494bp);5:(DNA/EcoR I＋Hind Ⅲ(SABC).

2.2单纯分泌型TNF-α基因真核表达细胞株的建立通过检测转染细胞阳性克隆的L-929细胞毒活性，筛选出活性较高的阳性克隆细胞各1株，分别命名为H-mTNF-α和H-sTNF-αm(图4)，并进行Westernblot分析(图5)。结果表明，①H-mTNF-α的培养上清可检出Mr17000的TNF-α，而裂解液可同时检出两种类型的TNF-α，且其固定细胞及培养上清均具有细胞毒效应；②H-sTNFm的细胞裂解液及培养上清均只可检出Mr17000的TNF-α，但只上清有细胞毒活性，细胞固定后其活性丧失，表明H-sTNF-α无mTNF-α活性而只具有sTNF-α活性。上述细胞毒效应均可被抗hTNF-αmAb所阻断(图4)。

图4转染TNF-α重组体的NIH3T3细胞对L929细胞的杀伤效应

Fig4 Cytotoxic effect of TNF-α recombinants transfected NIH3T3 cells on L929 cell line

图5TNF-α重<