［摘要］目的建立小鼠肥大细胞瘤P815种植瘤模型，并对其体内诱发特异性CTL应答机理进行初步的研究。方法经有限稀释法筛选P815单克隆瘤系，用RT-PCR及产物DNA测序鉴定肿瘤抗原P1A基因的表达；在此基础上，用活瘤苗免疫同系小鼠，经标准⁵¹Cr释放试验检测在体特异性CTL的活性。结果筛选出了一个P815单克隆成瘤系P815-F3，并鉴定该瘤存在P1A基因的表达；用活瘤疫苗免疫6只小鼠，在3只体内诱发出了特异性CTL应答。结论本研究成功地建立了P815肿瘤模型，对体内特异性抗瘤CTL效应的诱发和检测做了初步的研究，这为以后基于该肿瘤模型的肿瘤疫苗研究及相关肿瘤免疫学基础研究奠定了基础。

［中图分类号］R730.3［文献标识码］A

［文章编号］1000-8861（2000）05-0339-03

The establishment of mouse mastocytoma P815 model and it's application in cellular immune trials

ZOU Li-yun，WU Yu-zhang，JIA Zheng-cai，WAN Ying，ZHAO Jian-ping

（Department of Immunology， the Third Military Medical University， Chongqing 400038，China）

［Abstract］ObjectiveTo establish a mouse mastocytoma P815 model and make a preliminary study on the induction of specific CTL responses in this model． MethodsWe screened a monoclone P815 cell line by limiting dilution assay （LDA），and detected whether the cell line expresses gene P1A with RT-PCR and DNA sequencing． Then DBA／2 mice were immunized with the living P815 cells and monitored the specific CTL responses by⁵¹Cr release assay． ResultsWe have selected a cell line P815-F3 and identified the expression of P1A gene in this cell line；after immunization with the living P815-F3 cells，the anti-P815AB specific CTL responses could be detected in 3／6 mice．ConclusionAfter establishing the P815 tumor model，we make a preliminary study on the induction of specific CTL responses in vivo，proving that immunization with the living P815 cells could initiate anti-P815AB specific CTL responses in about 50％ mice．

［Key words］tumor immunity；animal model；cytotoxic T lymphocyte（CTL）

构建合适的肿瘤动物模型是研究肿瘤免疫学、临床前评价肿瘤治疗方案有效性和安全性的重要前提。小鼠肥大细胞瘤P815模型（源于DBA／2小鼠）是肿瘤免疫学中常用的动物模型之一，迄今在该模型^［1］已确定出至少5种不同的肿瘤抗原（P815A、B、C、D、E），其中两个的编码基因P1A和PIE也已被鉴定；而P1A基因^［2，3］是目前已知的唯一一个与人类肿瘤抗原MAGE基因家族表达相似的小鼠肿瘤抗原基因；另外，P815细胞株在体内、外都具有良好的增殖活性，且较稳定，适用于体外杀伤实验。本研究筛选出一个P815单克隆瘤系，并鉴定出该瘤系存在肿瘤抗原P1A基因的表达，进而在体观察了该瘤系的成瘤特征。在该模型初步建立的基础上，又观察了活瘤细胞疫苗在体诱发特异性CTL应答的现象，对该模型进行了初步的肿瘤免疫学研究。

1材料和方法

1．1动物DBA／2小鼠（H-2Ld），6～8周龄，由本校动物所提供。动物饲养及有关动物实验均在该所洁净室内进行（SPF级）。

1．2P815细胞为DBA／2小鼠来源的肥大细胞瘤系，购于上海细胞所，采用RPMI 1640加10％热灭活小牛血清完全培养基，于37 °C、5 ％CO₂孵育箱内常规培养。

1．3试剂Tripure购于Rocke公司；AMV、RNA抑制剂及polyoligo T购于Pomega公司；Taq酶及其缓冲液购于PE公司；dNTP购于上海生物工程有限公司。所用引物也均为上海生物工程技术有限公司合成。

1．4多肽的合成及纯度鉴定P815AB肽（序列为：LPYLGWLVF，H-2Ld限制）由我室于431A型多肽合成仪（PE公司）采用标准Fmoc方案合成，并由HPLC（Waters）鉴定纯度＞95％；取适量多肽溶于DMSO，浓度为1．5 μg／ul，存放于—20°C备用。

1．5有限稀释法筛选P815单克隆瘤系将P815细胞悬液连续稀释至细胞浓度为5个／ml，以200 μl／孔接种于96孔细胞培养板，置于孵箱中培养；7d后，观察单克隆生长情况，并挑取单克隆至25 cm²培养瓶中扩增培养。

1．6RT-PCR与DNA测序鉴定P1A基因的表达^［2］分别按照试剂使用说明，用Tripure抽提P815-F3细胞的RNA，既而进行逆转录反应和PCR扩增（PE公司5700型定量PCR仪），所用引物为：AB375（5’ATGGGTGCTGGCGCTAACTGT3’）及AB376（5’TCTTCTGGGCTTTGCAACTGC3’）；对照β-actin引物为：BLE7（5’TGGCGCTTTTGA-CTCAGGAT3’）及BLE8（5’AGCCCTGGCTGCCTCAAC-3’）。PCR反应过程为：94 °C 5 min预变性，94 °C 1 min—65 °C 2 min—72 °C 3 min，35个循环，72 °C延伸10 min。扩增完毕后，取部分产物进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认目标DNA条带。为了进一步证实PCR扩增产物源于P1A基因，用软琼脂回收PCR产物，送于基康公司测序。

1．7瘤细胞接种小鼠观察在体成瘤特征取6只DBA／2小鼠，分两组：一组在小鼠腹腔内接种活P815-F3细胞4×10⁵／只，每周观察小鼠的存活状况；另一组在小鼠背部皮下接种活P815-F3细胞1×10⁶个／只，每周观察小鼠的背部肿瘤结节的生长情况，测量其最长径和最短径，取其均值。

1．8活瘤细胞疫苗免疫小鼠、CTL诱导及其杀伤活性检测^［4］取6只DBA／2小鼠，每只尾根部皮下注射1×10⁶个P815-F3细胞／100 μl PBS；同时，取3只做为对照组，每只尾根部皮下注射100 μl PBS。1周后，分别取小鼠脾脏分离脾细胞，用10 ml含P815AB肽（1 μg／ml）的RPMI 1640完全培养基在25 cm²培养瓶中悬浮（细胞浓度不低于3×10⁶／ml），将培养瓶垂直放置于37 °C 、5％ CO₂孵箱中孵育。又1周后，取上述各组脾细胞，在96孔板分别以100∶1、50∶1、25∶1的比例与10⁴个⁵¹Cr标记P815-F3靶细胞相混合，同时设1 mol／L盐酸组以测定靶细胞的最大⁵¹Cr释放值及培养基组以测定靶细胞的⁵¹Cr自发释放值。37 °C，5％ CO₂孵育4 h后，200 g 离心5 min，吸取各孔上清，于本校同位素室采用γ闪烁记数仪分别测定所含放射量。按以下公式计算各组CTL杀伤效率：

⁵¹Cr的释放率％＝（实验孔⁵¹Cr释放值－自发释放孔⁵¹Cr释放值）／（最大⁵¹Cr释放值－自发释放孔⁵¹Cr 释放值）

2结果

2．1单克隆瘤系筛选共筛选出5个单克隆，分别命名为：P815-F3、I5、F4、G6、H4，镜下观察发现生长情况各不相同；P815-F3：细胞多呈圆形悬浮或半悬浮生长，细胞增殖较快；P815-I5：细胞多呈贴壁性生长，细胞增殖较快；余3株生长状况不佳。从克隆生长情况来看，P815-I5、P815-F3为两个生长特性相差很大的单克隆瘤株。

2．2RT-RCR产物电泳及测序结果PCR产物12％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果（见图1）；测序结果与Genebank（NM 011635）中获得的序列相吻合。

图1PCR产物12％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

Fig1Result of PCR product analyzed by 12％ polyacrylamide gel electrophoresis

1：DNA marker；2：P815-F3；3：β-actin

2．3在体成瘤特征腹腔接种组3只小鼠的存活期分别为：18、21、24 d，平均存活期为21 d，与文献报道相近，说明该克隆保持了P815瘤系高转移的特征^［5］；背部皮下接种组3只小鼠2周后可见有结节出现，3周后结节大小分别为：1．2 cm、1 cm、1．5 cm，平均瘤结节生长速度为1．2 cm／3周，与文献报道的1 cm／周相比较慢，说明该克隆的皮下成瘤性较差^［6］。

2．4活瘤苗体内诱发特异性CTL应答用活瘤细胞疫苗尾根部皮下免疫DBA／2小鼠，一周后取其脾细胞体外用P815AB肽再刺激7 d，以P815-F3细胞为靶细胞采用⁵¹Cr释放实验检测相应CTL杀伤效应，结果见图2。其中瘤苗免疫组6只小鼠中有3只的特异性杀伤率大于20％，可认为瘤苗在体内有效诱发了特异性CTL应答；余3只的特异性杀伤率与对照组3只小鼠相近，均小于20％，可认为瘤苗在它们体内未诱发明显的特异性CTL应答。

图2瘤苗免疫小鼠在体激发特异性CTL应答

Fig2Specific CTL responses induced by immunization of living tumor cells

3讨论

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