［摘 要］ 目的 建立一种广泛适用于临床上筛选抗体进行疾病诊断和在分子生物学研究中测试各种蛋白表达的快速、简便的检测方法。方法 用一种特殊的多孔滤膜装置同时给多份样品施加电场，将其吸附于NC膜，进行免疫测试，称之为外加电场固定液相分子快速斑点免疫分析。分别进行线性、灵敏度和干扰因素测试。用其筛选自身免疫性疾病患者抗豚鼠内耳抗体和豚鼠内耳bFGF、FGFR、NFκB、IGF1R分子的表达。结果 呈色反应的灰度值与抗体稀释倍数的对数之间具有很好的线性关系，相关系数r＝0.995，P＜0.0001。6.4％SDS不影响检测结果，灰度值与SDS浓度之间的相关系数r＝0.455，P＞0.05。其检测抗原灵敏度为23 ng，当待检样品中含99.86％杂蛋白时（待检蛋白0.149％），不能检出该分子。抗内耳抗体，31％（5／16）系统性红斑狼疮患者阳性，5％（1／19）类风湿病和强直性脊柱炎阳性，对照组2％（1／48）阳性。豚鼠内耳表达bFGF、FGFR、NFκB和IGF-IRα等4种分子。结论 外加电场固定液相分子快速斑点免疫分析是一种抗表面活性剂干扰的高效抗原抗体检测方法。

［中图分类号］ R392 ［文献标识码］ A

［文章编号］1000-8861（2000）05-0376-04

Rapid electric field immobilizing liquid phase molecule dot blot analysis

ZOU Jing

（Department of Otolaryngology，Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuang 050082，China）

［Abstract］ Objectives To establish an anti-surfactant influence，rapid and easy immune test method that can be widely applied in screening antibody clinically and analysing protein expression in basic research．Methods Several samples were quickly absorbed to nitrocellulose（NC）membrane under electric field in a special equipment with filling NC membrane．Then an immune assay was applied to detect the proteins．It was called rapid electric field immobilizing liquid phase molecule dot blot analysis（REILMD）．The linear quality，interference factors and sensitivity were tested．It was used to screen anti-inner ear autoantibody in auto immune diseases and to analyse the expression of bFGF、FGFR、NFκB and IGF1R in inner ear．Results A good linear relation existed between color response grey value and logarithm of dilution of antibody （r＝0.995，P＜0.0 001）．Even 6.4％ SDS does not affect the test results．The sensitivity is 23 ng of the protein．The molecule can not be detected in the presence of up to 99．86％ interference proteins．Anti-inner ear autoantibody existed in 31％（5／16）SLE，5％（1／19）rheumatoid arthritis and ankylosing spondysis，2％（1／48）non autoimmune disease contrast group．Guinea pig inner ear expresses bFGF、FGFR、NFκB and IGF1R．Conclusions REILMD is an anti-surfactant influence and highly effective immune test method．

［Key words］ immune test； surfactant； dot blot

迄今，通过免疫反应检测液相蛋白的方法主要有：ELISA、斑点免疫分析、免疫转印、同位素免疫磁珠方法等。ELISA方法对包被用蛋白要求非常高，因吸附能力有限，须用高纯度蛋白进行包被，尤其不能含有表面活性剂，且包被时间长。斑点免疫分析因采用吸附能力强的硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜作载体，可用粗制抗原测试，但同样严重受表面活性剂影响，且吸附时间长^［1～3］。免疫转印虽不受上述因素影响，但操作繁琐、费时，不能作为常规筛选方法，主要用于确定检测分子的分子量。同位素免疫磁珠方法不仅具有上述缺点，而且同位素会污染环境，危害健康。作者曾建立了电泳吸附斑点免疫方法，不受待测蛋白纯度和表面活性剂影响，但在需同时吸附多种蛋白分子时便不可行^［4］。后来将其改进而建立的NCMPE方法虽可进行较为精确定量，但同样不便一次吸附多种分子^［5］。ELISA方法受表面活性剂和过滤速度影响，各孔过滤速度必须绝对一致，否则，孔间差异大^［6］。作者在应用ELISA方法的过程中受到启发，设想如能给样品施加电场而不是负压将抗原吸附于NC膜，进行免疫测试，一切问题会迎刃而解。作者经过反复测试，建立了这种外加电场固定液相分子快速斑点免疫分析（rapidelectricfieldimmobilizingliquidphasemoleculedotblot，REILMD）方法，进行线性，灵敏度和干扰因素测试。用其筛选抗体和分析内耳特殊分子的表达。

1材料和方法

1．1材料二级杂色豚鼠16只，体重300～400g，雌雄不拘，购自北京中国药品生物制品检定所实验动物繁育场；兔抗bFGF、NFκB、IGF-IRα和鼠抗FGFR为SantaCruz公司产品；HRP-羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG为进口分装（均购自北京中山生物技术有限公司）；HRP-羊抗人IgG为卫生部北京生物制品研究所产品；NC膜（孔径0.3μm）为北京化工学校附属工厂产品。类风湿病（RA）患者19例，男3例，女16例；强直性脊柱炎（AS）患者19例，男18例，女1例；系统性红斑狼疮（SLE）16例，男4例，女12例；均来自我院中医科和皮肤科。对照组为无自身性疾病的其它疾病患者，共48例，来自其它各科。

77000X Easy-TiterTMELISASystem为美国PIERCE公司生产，EagleEyeTMⅡ型电泳图象分析系统为美国冷泉港公司产品。

1．2仪器改造先将一铂丝经排液孔插入ELIFA System缓冲液池，并弯曲成蛇形，其表面盖上滤纸，池内倒满转移电泳缓冲液（0.025mol／LTris，0.192mol／L甘氨酸，20％（v／v）甲醇，pH8.35），再按原说明书安装样品池底板，继续向缓冲液池注入缓冲液，直至其经96孔溢出，彻底驱赶孔内气泡（该步骤非常重要），小心将预先浸泡该缓冲液的NC膜放于底板硅胶片表面，勿使其下面留任何气泡。盖好样品池顶板并拧紧螺栓固定（另一硅胶片盖于NC膜表面）。将样品池96孔内注满缓冲液，勿留气泡。

1．3外加电场快速固定液相分子将蛋白混合物溶于样品缓冲液（0.063mol／LTris-HCl，pH6.8，2％十二烷基磺酸钠，0.1％溴酚兰，5％2-巯基已醇，10％蔗糖），每孔加入50μl样品，小心将多层滤纸盖在顶板96孔表面，滤纸间夹入蛇形弯曲的铂丝。上方铂丝接负极，缓冲液池铂丝接正板，200mA电泳10min。取下滤纸，丢弃缓冲液。

1．4免疫测试

1．4.1用抗原检测抗体线性测试：抗原为用样品缓冲液 1∶100稀释的正常人血清。丢弃缓冲液后，每孔加入200μl0.01mol／LpH7．4PBS-T，37°C摇洗5min，甩出后每孔加入200μl用含1％BSA的PBS稀释40倍的正常羊血清，37°C摇浴5min，甩出后每孔分别加入50μl从1∶200至1∶102 400倍比稀释的HRP-羊抗人IgG，每一稀释度做复孔，37°C摇浴10min。取出硝酸纤维素膜，用塑料膜密封，37°C高速摇洗3min2次，每孔加200μlDAB溶液，37°C摇浴10min。丢弃DAB溶液，用PBS-T漂洗片刻，用EagleEyeTMⅡ型电泳图象分析系统扫描测灰度值。

抗干扰能力分析：用样品缓冲液1∶100稀释人血清，分别加入牛血清白蛋白（BSA）和十二烷基磺酸钠（SDS），BSA浓度从204.8mg／ml至0.1mg／ml倍比递减，SDS浓度从6.4％至0.2％倍比递减，每一浓度设4孔。用1∶1 000HRP-羊抗人IgG识别，操作同上。

用该方法筛选自身免疫性疾病患者抗豚鼠内耳抗体：将豚鼠按我们曾经报导的方法制备膜迷路蛋白^［7］。用0.9mg／ml粗制豚鼠膜迷路蛋白为抗原，同上在电场作用下固定于NC膜，用样品缓冲液将类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强值性脊柱炎患者血清1∶10稀释。HRP-羊抗人IgG为1∶1 000稀释，操作同上。

1．4.2用已知抗体检测特定蛋白分子检测灵敏度分析：将4份人血清用上述样品缓冲液从1∶100至1∶204 800进行倍比稀释，每孔加入50μl样品，同上电泳，并用1∶1 000 HRP-羊抗人IgG识别，操作同上。应用该方法检测豚鼠内耳特殊分子的表达：将1．8mg／ml粗制豚鼠膜迷路蛋白用样品缓冲液从1∶2至1∶8倍比稀释，兔抗bFGF、FGFR、NFκB、IGF1R抗体从1∶50至1∶1 600倍比稀释，方阵滴定。检测豚鼠内耳上述分子的表达。

1．5统计学分析所有数据用SPSS软件进行统计分析。

2结果

2.1用抗原检测抗体结果

2.1．1线性测试结果：呈色反应灰度值与抗体稀释倍数的对数之间具有很好的线性关系，相关系数r＝0.995，P＜0.0001，稀释倍数为1∶800至1∶25 600时直线关系最好（见图1）。

图1不同抗体稀释度的REILMD分析结果

Fig1ResultofREILMDassaywithvariousdilutedantibody

A～C：1∶100dilutedhumanserum；D：PBScontrast；antibodydilution：