［摘 要］ 目的 对人IFN-α2b基因进行突变和修饰，从翻译水平上调控IFN-α2b基因在大肠杆菌中的表达。方法 采用PCR技术，人工合成寡核苷酸引物，对人IFN-α2b基因进行了改造：在不改变氨基酸的前提下，将5’端编码区的四个G、C位点突变为A、T；去除3’端非编码区。将突变和修饰后的基因片段分别克隆入原核表达载体pBV321，在大肠杆菌中进行表达。对表达产物进行活性效价测定。结果 3’端删除非编码区，表达水平比删除前提高4倍；5’端四个位点突变，表达水平比突变前降低2倍。结论 IFN-α2b基因的3’端非编码区抑制其在原核系统的表达，删除该区可提高表达水平。

［中图分类号］ R392.1 ［文献标识码］ A

［文章编号］1000-8861（2000）05-0355-04

Mutagenesis and modifications of IFN-α 2b gene affect the expression level in E．coli

Hu Shou-wang

（Health and Epidemic Prevention Station of Guangdong Province，Guangzhou 510300，China）

Liang xi-ruo

（Guangzhou Medical College，Guangzhou 510182，China）

Wu shu-hua

（Institute of Virology，Chinese Academy of Preventive Medicine，Beijing 100052，China）

［Abstract］ Objective To investigate the effects of mutation and modification of human IFN-α2b gene and translational control of the expression of IFN-α2b gene in E．coli．Methods PCR was pertormed as follows：four G and C bases in 5’ terminal were substituted with A or T，without altering the amino acid sequence；the downstream of stop codon TAG in the 3’terminal non-coding region was removed．The mutated and modified genes were then cloned into expressing vector pBV321 and expressed in E．coli respectively． The activity and potency of expressed proteins were determined．Results The highest level of expression was obtained by removal of 3’ terminal non-coding region（four times as much as the original value）；by mutation of 4 sites the 5’ terminal，the expression level was 0.5 times as compared to that of the original level．Conclusion IFN-α2b gene 3’terminal non-coding region hinders the expression in E．coli，and it is feasible to increase the expression level by removal of the region．

［Key words］ IFN-α2b gene；PCR；3’non-coding region；5’TIR；regulation of expression

干扰素（IFN）是一类具有复杂生物学活性的细胞因子。作为病毒性、免疫病理性和肿瘤等疾病的生物治疗手段，天然和重组IFN在临床上应用日益广泛。国内外重组IFN-α2b的开发研究是将人IFN-α2b基因的编码区连同其3’端非编码区克隆入表达载体，在原核系统获得较高表达水平。本研究的目的是对人IFN-α2b基因进行5’端突变和3’端修饰，从翻译水平上调控IFN-α2b基因在原核系统的表达，以求进一步提高表达水平。

1材料与方法

1.1DNA片段、质粒载体pBV27：插入IFN-α2b基因全序列的pBV321质粒；pBV321：原核系统高效表达载体。以上载体由中国预防医科院病毒所病毒基因工程国家重点实验室提供。

1.2细胞、菌株、病毒WISH细胞株（对VSV敏感，用于干扰素生物学活性的测定）、VSV（水泡性口腔炎病毒）、DH5α、JM103、JM109菌株，由病毒所基因室提供。

1.3酶类T₄DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、以及EcoRⅠ、XbaⅠ、PstⅠ、PvuⅡ、HindⅢ、ClaⅠ等限制性内切酶，以及核糖核酸酶、溶菌酶、细胞消化胰酶等，分别购自美国Promega、NewEnglandBiolabs公司、德国BoehringerMannheim公司，以及华美、天象人等公司。

1.4试剂丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、TEMED、SDS（电泳级）购自美国SERVA公司。X-gal、IPTG：美国Promega公司。其它试剂和材料分别购自相关国内外公司。

1.5PCR引物设计和合成

5’端引物序列：5’-GCTCTAGAATGTGTGATTTACCTCAAACTCATAGCCTGGGTAGC…3’

5’端原序列：5’…AATTCATGTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGC…3’

3’端原序列：5’…TAAGAAGTAAGGAATGAAAACTGGTTCAA…3’

3’端引物序列：3’…ATTCTTCATTCCTTACTATTGACGTCTT-5’

5’端引物中有4个突变位点，并引入XbaⅠ酶切点；3’端引物中增加TAA终止子及PstⅠ酶切点。

1.6聚合酶链反应（PCR）PCR反应系统：DNA模板（pBV27／XbaⅠ、PstⅠ）10³～10⁷拷贝／反应，上下游引物各0.25μmol／l，dNTP250 μmol／L，MgCl₂ 1．5～4．5 nmol／L。95 °C 1 min，50～64 °C退火1 min，72 °C延伸10 min，30个循环扩增后，再72 °C延伸10 min。取5 μ1样品于1.2％琼脂糖电泳鉴定。

1.7分子克隆和亚克隆技术按照参考文献［1］进行。

1.8核苷酸序列测定PCR产物片段插入pGEM-T载体中，在Mode1373A自动测序上完成测序。

1.9重组人IFN-α2b基因在大肠杆菌中的表达及样品制备选择含IFN-α2b表达质粒的单菌落，LB培养基中37 °C活化过夜，1∶10二次活化8 h。收集OD₆₅₀值1.0的菌液，5 000 r／min 5 min，将沉淀重新悬浮于缓冲液中，超声波裂解或加溶菌酶至1 mg／ml冰浴作用30 min，加0.2 mmol／L EDTA（或直接放－20 °C）终止反应。冻溶3次，15 000 r／min 15 min，上清即为粗制干扰素。

1.10重组人IFN-α2b抗病毒活性及效价测定采用VSV-WISH细胞病变抑制法^［2］。WISH细胞悬液加入96孔板培养，每孔100 μ1。5％ CO₂孵箱37 °C过夜，去除培养液，加4倍比稀释的干扰素溶液，37 °C、5％CO₂孵育过夜后，弃干扰素溶液，用50～100TCID₅₀的VSV攻击，37 °C、5％ CO₂培养1～2 d，待对照孔的细胞75％以上发生明显病变时记录结果。用能抑制50％细胞病变的最高稀释度作为1个干扰素单位。

1.11表达产物SDS-PAGE电泳分离胶和浓缩胶的浓度为12％和5％，上样后恒压电泳，浓缩胶100 V，分离胶180 V。电泳完成后，考马斯亮蓝R250染色。

2结果

2.1IFN-α2b基因的定点诱变和修饰人工合成寡核苷酸引物，在引物指导下，对IFN-α2b基因进行突变和修饰，PCR扩增出新的基因片段。所有的突变和修饰只改变DNA序列，而不改变其翻译所得的氨基酸序列。结果，在5’端将4个位点的G、C突变为T、A，3’端删除全部非编码区330 bp（包括其中的TA富集序列），并增加原核强终止子TAA，这样，使基因序列由850 bp缩短到520 bp。PCR产物经过1.2％琼脂糖电泳，结果显示明显的520 bp大小的亮带（见图1）。

图1PCR扩增突变和修饰后的IFN-α2b基因琼脂糖凝胶电泳图

Fig1ElectrophoreticpatternofIFN-α2bgeneafterPCRamplification

1：p27／EcoRⅠ；2：PCRproduct；3：λDNA／HindⅢmarker

2.2PCR产物IFN-α2b基因的核苷酸序列测定PCR产物用1.2％琼脂糖电泳回收、纯化，与pGEM-T载体连接，构建成测序载体pGEM-TIFNab。对插入测序载体的IFN-α2b基因序列进行DNA序列分析。结果表明：PCR扩增产物序列与实验设计序列完全相符（测序图略）。

2.3重组IFN-α2b基因原核表达载体的构建与原序列相比，PCR获得的IFN-α2b基因片段有5’端核苷酸突变和3’端非编码区删除修饰。为了分别研究这两个区域的变化对表达水平的影响，实验中利用PvuⅡ、XbaⅠ及PstⅠ位点，对基因片段进行重新酶切、连接组合，总共有4种组合的片段：①5’端突变、3’端删除非编码区（命名为IFNab）；②5’端突变、3’端保留非编码区（命名为IFNad）；③5’端不变、3’端删除非编码区（命名为IFNcb）；④5’端不变、3’端保留非编码区（命名为IFNcd）。将以上基因片段分别插入同种载体pBV321，分别得到相应的4种表达载体pIFNab、pIFNcd、pIFNcb及pIFNad。构建程序见图2。

图2原核表达载体pIFNab、pIFNcd、pIFNad及pIFNcb的构建

Fig2ConstructionofexpressionplasmidspIFNab、

pIFNcd、pIFNadandpIFNcb

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