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［中图分类号］R329．25［文献标识码］A
Expression of human CD20 gene in recombinant vaccinia virus
HONG Hai-yanQI Zhong-tian
（Microbiology Department of Second Military Medical University，Shanghai 200433，China）
GUO Yan-xiangSHU Cui-lingSHEN Bei-fen
（Beijing Basic Medical Institute，Beijing 100850，China）
［Abstract］ObjectiveTo obtain human recombinant CD20 molecule and study the expression of human CD20 in vaccinia virus． MethodsThe full length gene of CD20 was inserted at the SmaⅠ site of pJSA1175 expression vector under the control of 7．5K promoter． The recombinant plasmid were used to construct recombinant vaccinia virus． ResultsCD20 molecule was expresssed in the membrane of the infected cells． Tilter of the recombinant vaccinia virus is 1×109pfu／ml．ConclusionThis experiment provides a new approach to study the function of CD20 which will also lay a foundation of preparation for the mAb against CD20.
［Key words ］human CD20；recombinant vaccinia virus；gene expression
CD20是B细胞表面的特异性抗原结构，调控B细胞的分化和成熟［1］。作为B细胞表面标志性抗原，CD20分子和CD19分子的过度表达与许多B细胞淋巴瘤密切相关。目前CD20抗体已被FDA批准用于淋巴瘤的治疗，而国内有关CD20分子的研究报道不多。应用痘苗病毒载体系统作为基因载体表达外源基因产物，国内外均有文献报道，其表达产物具有与天然产物相近的生物活性和理化性质，较原核及酵母系统表达产物更接近于天然［2］。痘苗病毒载体系统的另一特点是重组痘苗病毒具有较好的免疫原性。本实验将编码人CD20的cDNA重组到痘苗病毒载体pJSA1175中，构建含人CD20编码cDNA的重组痘苗病毒，希望获得能够表达CD20的重组病毒，用于CD20分子的功能研究及单抗或多抗研制。
1材料和方法
1．1材料pGEMT-EASY／CD20 含有CD20编码cDNA，由本室构建；TK－143细胞、pJSA1175质粒、Mc1061菌及天坛野生痘苗病毒由本室保存。脂质体，Klenow酶、T4连接酶等及培养MEM培养基为GIBCO产品。DNA纯化试剂盒为Clontech产品；Budr及X-gal为Sigma产品。CD20 mAb购自天津血液研究所；FITC标记的羊抗鼠抗体及羊抗鼠抗体购自百灵克公司。
1．2细胞培养TK－143细胞为贴壁细胞，用含10％小牛血清的MEM完全培养基培养，培养液中含有250 ng／ml的Budr，病毒感染细胞时用的维持液为含2％小牛血清的MEM完全培养基。
1．3重组病毒构建天坛野生痘苗病毒感染50％～90％贴壁的TK－143细胞后，移出病毒液，逐滴加入脂质体-DNA混合液，4～5 h后，补加维持液，继续培养48 h。反复冻融3次，收集全部培养液作为病毒原液，将其作对数稀释，取不同稀释度的病毒液分别感染细胞。48 h后移出上清，铺加营养琼脂，挑取蓝斑，放于1 ml维持液中。反复冻融3次，取0.5 ml液体感染细胞，连续挑取蓝斑纯化3代。
1．4结晶紫染色计噬斑数病毒感染48 h后，倒掉培养液，加1 ml结晶紫染液，室温放置5 min后，用水冲去浮色，计蚀斑数。
1．5APAAP方法碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标技术简称为APAAP，其基本操作如下：细胞涂片丙酮吹干后，用含15％牛血清的PBS 37 °C封闭30 min；滴加CD20 mAb，室温30 min，PBS洗3次；滴加羊抗鼠IgG，室温30 min，PBS洗3次；滴加APAAP复合物室温30 min，PBS洗3次；滴加显色液（含1 mg／ml坚固红）室温10 min；甲基绿复染，明胶封片。
2结果
2．1pJSA1175重组质粒构建按图1方案进行。平端连接会出现两种情况，正向插入和反向插入。因pJSA1175载体含两个EcoR Ⅰ位点中间相距400 bp重组质粒，人CD20编码cDNA在369位也存在EcoR Ⅰ位点，重组质粒用EcoR Ⅰ酶切，得到930和370 bp两个片段，为反向插入，得到770和530 bp两个片段，则为正向插入（见图2）；电泳结果与预期结果相符，证明重组质粒连接正确。
图1重组痘苗载体构建
Fig1Schematic construction of pJSA1175／CD20
图2重组质粒鉴定
Fig2Restriction maps of pJSA1175／CD20
1：DNA MW standard：DL-2000；2：pJSA1175 EcoR Ⅰ；3：pJSA1175／CD20 EcoR Ⅰ；4：pJSA1175／CD20（reverse inserted） EcoR Ⅰ
2．2蓝斑筛选重组病毒在BudR选择压力下扩增重组病毒，借助与外源基因同步表达的lacZ在底物 X-gal的存在下显示蓝色的噬斑而挑选出重组痘苗病毒。经过4次单克隆传代，蓝斑数目逐渐增多，由最初8个蓝斑，到第二代31个蓝斑，直到最后镜下观察，形成的病毒噬斑达到100％蓝斑，表明重组病毒纯度已达要求。
2．3CD20分子的表达检测用CD20重组痘苗病毒和天坛野生痘苗病毒分别感染TK－143细胞，24 h后做APAAP检测。结果表明：重组痘苗病毒感染的TK－143细胞胞膜及胞浆呈明显的红色，而野生病毒感染的TK－143细胞胞膜及胞浆为透明（见图3）。提示重组痘苗病毒表达的人CD20分子具有特异性与标准抗人CD20 mAb结合的能力，而且被正确转运并定位到重组病毒感染的细胞膜上。
图3APAAP染色检测CD20分子的表达
Fig3Finding of APAAP staining
A：wild virus-TK－143； B：recombinant virus-TK－143
2．4重组病毒滴度测定富集的重组病毒液用维持液做对数稀释，取1×10－4～1×10－7稀释度的病毒液（总体积2 ml）感染50％～90％贴壁的TK－143细胞，感染48 h后，结晶紫染色。随着稀释度增大，蚀斑数逐渐减少，1×10－7稀释度共有187个噬斑，所以病毒滴度约为1×109 pfu／ml。
3讨论
CD20分子作为B细胞表面标志性抗原，CD20分子和CD19分子越来越引起人们的关注，二者的过度表达与许多B淋巴细胞瘤密切相关，在B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤等疾病中，它们的表达量异常增高，磷酸化增加［3］。近年来的研究发现，同样是B细胞表面标志，CD20分子比CD19分子更具特异性。已经证明：B淋巴瘤细胞表面表达CD20分子，白血病的未成熟细胞表面表达CD33分子，乳腺癌细胞表面表达HER2／neu抗原，以这些抗原对应的抗体对肿瘤进行治疗，具有相当的疗效，进一步发展完善并与放疗和化疗结合起来，可望治疗人类的某些恶性肿瘤［4］。
氨基酸序列分析预测，CD20分子是一种跨膜蛋白，带有4段跨膜区域，其氨基端与羧基端都在胞内［5］。在原核系统中表达的可溶性人CD20分子不为其抗体所识别，不能作为抗原免疫动物制备抗体。人的骨髓瘤细胞Raji和Daudi表面均表达CD20抗原，但这两种细胞表面除CD20外，还表达许多其它的人源性抗原，若用来免疫小鼠会产生许多非特异性的抗体，为筛选带来困难。用重组病毒免疫小鼠，病毒可整合到被感染细胞的基因组中，在细胞膜上表达CD20分子，随着病毒的不断复制，表达CD20分子的细胞会不断增多。同时，痘苗病毒本身具有强大的佐剂效应，可诱发小鼠产生抗体反应。CD20重组痘苗病毒的获得，为CD20 mAb的研制提供了一条简单可行的方法。
CD20与体内其他已知抗原蛋白无任何同源性。但它4次穿膜的分子结构与离子通道蛋白非常相似。有人将CD20的编码基因在Balb／c 3T3细胞中表达，发现重组细胞可以单独在胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）的诱导下发生DNA的合成，并进入分裂期。进一步的研究发现，IGF-Ⅰ首先作用其受体（IGF-IR），IGF-IR再激活CD20的离子通道活性，诱导G1期进程，因此，CD20是通过发挥离子通道的作用对B细胞的成熟与分化进行调控［6，7<
