［摘 要］ 目的 筛选能结合酪氨酸蛋白激酶受体EphB2的功能短肽。方法 PCR扩增EphB2的配体结合区，定向克隆到融合表达质粒载体pRSET A中，阳性克隆经IPTG诱导表达融合蛋白，并利用Ni-NTA金属螯合亲和层析在变性条件下对表达的蛋白进行纯化，以此纯化蛋白为靶，将其包被于ELISA板上，进行3轮亲和筛选。结果 电泳分析表明：表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在，纯化蛋白质的纯度大于95％。从噬菌体随机12肽库中筛选到13个噬菌体阳性克隆。结论 获得了具有结合EphB2活性的阳性噬菌体克隆且有共同的基序。

［中图分类号］ Q78 ［文献标识码］ A

［文章编号］1000-8861（2000）05-0342-04

Screening of the bioactive peptides that bind to tyrosine kinase receptor EphB2

ZHANG Xiao-guangHAN JiongLIU Xin-pingYAO Li-boNIE Xiao-yanSU Cheng-zhi

（Department of Biochemistry and Molecular Biology，the Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China）

HAN Jing-tian

HAN Jing-tian（Department of Micorobiology，Medical College of Chinese People’s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China）

［Abstract］ Objective To screen and identify the bioactive peptides that bind to tyrosine kinase receptor EphB2．Methods The gene encoding the ligand binding domain of EphB2 was cloned into the expressing vector pRSET A，under induction with IPTG，the fusion protein was expressed and purified under denaturing condition using metal chelate chromatography．The purified protein coated on ELISA plate was used as target to carry out three rounds of affinity selection．Results SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein mainly existed in inclusion bodies．The purity was up to 95％，13 positive phages were isolated from a random phage-displayed twelve-peptide library．Conclusion Peptides that could interact specifically with EphB2 were obtained and there were common motifs among the sequences of them．

［Key words］ EphB2；expression；metal chelate chromatography；phage display；random peptide library

EphB2属于已知最大的酪氨酸蛋白激酶受体Eph家族^［1］，在胚胎发育及出生后的生命进程中的表达呈现差异性、重叠性及时空性^［2］，在神经轴突导向、血管发生、肿瘤形成等方面具有重要功能^［3］。90年代初兴起的肽库技术，为细胞信号传导研究、小分子药物设计、重组疫苗研制、抗病毒药物筛选带来一场革命^［4］。其筛选的共同点是钓取与蛋白（如抗体，受体，酶）特异性结合的配基。这种筛选功能性短肽的研究策略对于EphB2及其配体的研究有很大的借鉴意义。我们构建his融合蛋白表达载体并表达纯化了EphB2的配体结合结构域，以该蛋白为靶子，从噬菌体多肽库中筛选能结合EphB2受体的模拟短肽。

1材料与方法

1.1材料螯合亲和层析介质（Ni-NTA）购自德国QIAGEN公司。PH.D.-12噬菌体表面呈现随机12肽库试剂盒，购自NewEnglandBiolabs公司。

1.2方法

1.2．1融合蛋白的表达及检测：将本室经PCR扩增，测序正确的EphB2的配体结合结构域编码基因用BamHⅠ和EcoRⅠ从保存载体pUC19中切下，klenow补平，亚克隆入pbluescript（-）的SmaⅠ位点，反向插入的克隆用BamHⅠ和EcoRⅠ切下，连接到同样双酶切的pRSET A载体（invitrogene，USA）中，转化E．coliJM109（DE3）（华美公司）感受态细胞，含目的基因片段的阳性克隆接种到5 ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C振荡培养3 h，当A₆₀₀约为0.8～0.9时，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol／L，诱导3 h，取1 ml菌液离心收菌，加入上样缓冲液，沸水浴加热5 min，12 000 r／min离心5 min后进行SDS-PAGE。

1.2.2重组蛋白的纯化：将5 mlLB培养基过夜培养的阳性表达菌接种到500 ml含氨苄青霉素（50 mg／L）的LB中，按前述方法诱导融合蛋白的表达并收集菌体，加入超声缓冲液（50 mmol／LNaH₂PO₄ pH7．8，300 mmol／LNaCl）重悬菌体（10 ml／g湿菌体），并加入溶菌酶至终浓度为1 g／L，室温作用30 min后，超声裂菌（150 W×1 min×5次）后4 °C 12 000 r／min离心15 min，弃上清，沉淀即为包涵体，重新悬浮于20 ml缓冲液A（6 mol／L盐酸胍，0.1 mmol／LNaH₂PO₄，0.01 mol／L Tris-Cl，pH8.0）中，室温磁力搅拌2 h，使包涵体完全溶解，用0.22 μm微孔滤膜过滤，将上清液上到用缓冲液A平衡过的Ni-NTAagarose柱上，然后分别用5倍柱体积的缓冲液B（8 mol／L尿素，0.1 mmol／L NaH₂PO₄，0.01 mol／LTris-Cl，pH8．0），10倍柱体积的缓冲液C（同缓冲液B，pH6．3），2倍柱体积缓冲液D（同缓冲液B，pH5．9），2倍柱体积缓冲液E（同缓冲液B，pH4．5）洗柱，最后用10 ml缓冲液F（缓冲液C中含250 mmol／L咪唑）对目的蛋白进行特异性洗脱，分步收集，每管约1 ml。取各管收集液10 μ1，加入等量2×上样缓冲液，37 °C温育10 min，经15％SDS-PAGE检测，将含有目的蛋白的各管合并。

1.2.3变性表达蛋白的复性：采取逐步降低尿素浓度的方法，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性。先用含6 mol／L尿素的PBS缓冲液4 °C透析过夜，然后分别用4 mol／L，3 mol／L，2 mol／L，1 mol／L，0.5 mol／L的梯度透析各4 h以上，最后用PBS缓冲液再透析4 h以上。透析结束后，将蛋白溶液在4 °C下12 000 r／min离心10 min，上清即为可溶的复性蛋白。将其分装后冻干备用。

1.2.4结合EphB2受体的功能短肽的筛选：以0.1 mol／L的NaHCO₃（pH8．6）调整可溶的复性蛋白为100 μg／ml，加入1.5 ml该蛋白至聚苯乙烯培养皿中，4 °C包被过夜。加5 mg／mlBSA-0.1 mol／LNaHCO₃（pH8．6），4 °C封闭1 h，TBS-0.1％Tween20洗板6次，加入1 mlTBST稀释的2×10¹¹（10 μ1原库）噬菌体上清，25 °C孵育1 h，TBS-0.1％Tween洗10次，洗去非特异性结合的噬菌体，然后加入1 ml0.2 mol／LGlycine*HCL（pH2．2），温和振荡10 min，洗脱特异性结合的噬菌体，用150 μ11mol／LTris*Cl（pH9．1）中和，立即加入20 ml对数生长期ER2537，37 °C孵育4.5 h，扩增特异性吸附的重组噬菌体。以PEG／NaCl沉淀噬菌体上清，在LB／IPTG／X-gal平板上测定扩增噬菌体的滴度，由此完成一轮panning筛选。用2×10¹¹ pfu的第1轮洗脱噬菌体加至同样包被的平板，进行第2轮panning筛选。重复进行第3轮panning后，不需扩增，在LB／IPTG／X-gal平板上挑取噬斑进行测序。

1.2.5ELISA法检测噬菌体表面呈现小肽的结合活性：第3轮筛选结束后，从LB／IPTG／X-gal平皿上随机挑选50个分隔良好的兰色噬斑，分别接种在对数生长期ER2537中，37 °C培养4.5 h，培养物离心后，取上清即为单个克隆的重组噬菌体。96孔酶联板上，实验孔均用100 ng靶蛋白／100 μ1／孔包被，阴性对照孔用200 μ1 0.5％BSA包被，4 °C包被过夜，2％BSA-TBS，4 °C封闭1～2 h后，实验孔加入200 μ1待测阳性克隆的噬菌体上清为待检小肽，25 °C反应2 h，PBST-0.05％Tween20洗板6次，每孔加入稀释至工作浓度的HRP／鼠抗M13噬菌体抗体。室温反应1 h，PBST-0.05％Tween20洗板6次，加入ABTS显色溶液，室温显色，测410 nm处每孔的OD值。

1.2.6与EphB2受体结合的噬菌体小肽的序列测定：从4 °C贮存的阳性克隆菌种，接种于ER2537培养液中，37 °C振荡培养4.5 h，按M13 DNA提取试剂盒说明书提取M13噬菌体单链DNA，紫外定量，取100 ng作模板，－96gⅢ测序引物，PE公司自动ABI PRISM^TM310测序仪测序。

2结果

2.1融合蛋白的表达从图1可见重组菌有一明显的20 kD左右新生蛋白带，薄层扫描分析显示：蛋白的表达量约占菌体蛋白的27％。对表达蛋白的可溶性分析表明：融合表达产物主要以不溶的包涵体的形式存在。

图1蛋白表达形式的SDS-PAGE电泳分析

Fig1SDS-PAGEanalysisfortheexpressionform

D：deposition； S：supernatant；T：totallysateoftherecombinantE．coli；E：lysateofhostE．coliwithemptyvector；

M：markers：97．4 ku；66．2 ku；43．0 ku；31．0 ku；14．4 ku（fromtoptobottom）

2.2重组蛋白的纯化从重组菌中制备的包涵体经洗涤后，用盐酸胍变性，上到Ni-NTA金属螯合亲和层析柱上，利用咪唑置换，洗脱下特异结合的蛋白。由15％的SDS-PAGE（见图2），利用这种方法可有效地纯化目的蛋白，经薄层扫描分析纯度可达90％以