［摘 要］ 目的 通过体外分离、增殖培养获取γδ Τ细胞、NK细胞和LAK细胞，并比较3种细胞的抗肿瘤的生物学特性。方法 收集用不同单抗分别包被粘附的细胞，通过MACS细胞分选仪的分选，获取的细胞进行细胞增殖动力学、细胞表型、细胞杀伤活性的测定以及单抗阻断效应的分析。结果 经MACS分离得到的γδ Τ细胞，培养2周后细胞数扩增600～800倍，CD3、CD8和γδ细胞表达阳性率分别是72.29％、58.02％和65.98％。γδ Τ细胞对NK敏感细胞K562以及NK不敏感细胞Raji和XG-7这3种不同靶细胞均有较高的杀伤率，分别为35.98％、52.27％和69.08；NK细胞对此3种细胞的杀伤率分别是45.21％、12.34％和29.27％；LAK细胞的杀伤率分别为44.01％、29.27％和25.68％。γδ Τ细胞对经MHC-Ⅰ类单抗阻断前后的K562、Raji和XG-7 3种靶细胞的杀伤率无明显改变。结论 γδ Τ细胞、NK细胞和LAK细胞都具有一定非特异性杀伤肿瘤细胞的作用；γδ Τ细胞对MHC-Ⅰ类单抗阻断后的肿瘤细胞的杀伤无明显变化。提示γδ Τ细胞较NK细胞和LAK细胞有更广泛的抗瘤谱。

［中图分类号］ R 292.12 ［文献标识码］ A

［文章编号］1000-8861（2000）05-0346-03

Comparative analysis of the characteristics of γδ T cell and LAK

MA An-lun，GE Hai-liang，ZHANG Dong-qing，WANG Shu-jun，ZHOU Guang-yan

（Shanghai Institute of Immunology，Shanghai 200025，China）

［Abstract］ Objective As the function of γδ T cells and NK in the immunological therapy becomes more and more important，the characteristics of γδ T cells，NK and LAK were analyzed comparatively after that they were amplified by isolating and incubating in vitro． Methods The cells were collected using MACS after the cells were panned respectively with special monoclonal antibodies．Then the characteristics including proliferation，phenotype，cytotoxin and the down regulation blocked by specific antibodies were analyzed．Results The γδ T cells can expand 600～800 times after incubation for 2 weeks，and the percent of CD3，CD8 and γδ expressed on the collected cells were 72．29％，58．02％ and 65．98％ respectively．γδ T cells showed high cytotoxcity to K562 （NK sensitive tumor cell line），Raji and XG-7 cell lines （NK non-sensitive tumor cell lines）．The percentage of cytotoxin reached 35．98％，52．27％ and 69．08％ respectively compared with γδ percent of cytotoxin of PBMC only revealed 19．56％，11．34％ and 10.58％，of NK showed 45．21％，12．34％ and 29．27％ while that of LAK were 44．01％，29．27％ and 25．68％ respectively．No obvious change of percent of γδ cytotoxic ability to these target cells were observed using special MHC class Ⅰ monoclonal antibody to block the γδ cell before coculturing the target cells with γδ T cells．Conclusion All of γδ T cells，NK and LAK showed the non-specific cytotoxin to tumor cells．The cytotoxic capability of γδ T cells wad not affected after blocking with MHC class Ⅰ monoclonal antibody．These results demonstrated that γδ T cell could kill more kinds of tumor cells than NK and LAK．

［Key words］ γδ T cells； LAK cells； cytotoxin

肿瘤细胞的弱免疫原性是其得以逃逸机体免疫监视功能的重要原因之一。肿瘤细胞不表达或低表达MHC-Ⅰ类分子使得肿瘤特异性的MHC限制的CD4或CD8的αβΤ细胞难以激活而产生免疫效应来有效地清除肿瘤细胞。自1986年SAITO等人首次报道了T细胞中的一个新亚型——γδΤ细胞以来，它对多种肿瘤细胞具有明显的识别与杀伤作用已被证实^［1］。多数认为γδΤ细胞对肿瘤细胞的识别过程不受MHC分子的限制^［2］。本文就体外分离和增殖培养得到的γδΤ细胞、NK细胞和LAK细胞，比较了3种细胞的抗肿瘤的生物学特性，以便摸索一种在肿瘤过继性免疫治疗中更具有临床应用价值的治疗手段。

1材料与方法

1．1细胞株与主要试剂人红白血病细胞株K562；人淋巴瘤细胞株Raji；人Buritts淋巴瘤细胞株Daudi（美国ATCC）；人多发性骨髓瘤细胞株XG-7（苏州医学院张学光教授惠赠）；MACS单抗磁珠（基因公司）；抗CD3，CD4，CD8，CD56单抗，抗γδ、αβ单抗（BD公司）。

1．2方法

1．2.1LAK细胞的培养：正常人PBMC用500U／mlrhIL-2的RPMI-1640营养液培养。

1．2.2γδΤ细胞的富集和培养：将正常人PBMC置于预先经抗CD3单抗包被的培养板内，用500U／ml的rhIL-2的RPMI-1640营养液培养5d。收集细胞，用CD4、CD16、CD56单抗标记的磁珠作MACS细胞阴性分选，将分选得到的CD4^－、CD16^－、CD56^－细胞置于预先经抗γδ单抗包被的培养板内，同时加入经60 Gy⁶⁰Co照射的Daudi和XG-7细胞（淋巴细胞∶肿瘤细胞为2∶1），用500U／ml的rhIL-2的RPMI-1640营养液培养。

1．2.3NK细胞的富集和培养：将正常人PBMC置于预先经抗CD56单抗包被的板内，用500U／ml的rhIL-2的RPMI-1640营养液培养5d。然后收集细胞用CD16、CD56单抗标记的磁珠作MACS细胞阳性分选，得到的CD16^＋、CD56^＋细胞经500U／ml的rhIL-2的RPMI-1640营养液培养。

1．2.4免疫表型分析：采用常规免疫荧光方法及流式细胞仪分析。

1．2.5体外细胞毒测定：参照CytoTox96^TMNon-RadioactiveCytotoxinAssayKit（Promega）说明书，采用4 h-LDH释放测定法，并计算出杀伤活性^［3］。

1．2.6抗MHC-Ⅰ类单抗的阻断效应：抗MHC-Ⅰ类单抗以及无关单抗分别与靶细胞作用4°C，30min，然后按2.5方法检测γδΤ细胞对靶细胞的杀伤活性。

2结果

2.1γδΤ细胞、NK细胞及LAK细胞的细胞增殖动力学用活细胞定量计数法观察γδΤ细胞、NK细胞及LAK细胞的细胞增殖效应。γδΤ细胞在培养2周后达到高峰，细胞数扩增达600～800倍，5周后增殖速度开始下降 ，7周时细胞基本停止增殖。NK细胞在培养1周时增殖速度不明显，到2周后细胞内颗粒明显增多，细胞体积变小，逐渐趋于死亡。LAK细胞培养3d后开始增殖，在3周后达到高峰，以后增殖速度逐渐下降。

2.2γδΤ细胞、NK细胞及LAK细胞的细胞表型分析经MACS分选得到的γδΤ细胞、NK细胞以及LAK细胞用免疫荧光方法检测其不同的细胞表型。γδΤ细胞、NK细胞及LAK细胞的CD3细胞百分率分别为72.29％、53.69％与80.81％。γδΤ细胞中的CD8细胞百分率高达58.02％，高于PMMC组23.97％；NK组46.32％和LAK组48.27％，γδΤ细胞中的αβ细胞百分率为28.34％，低于正常PBMC组（65.01％）和LAK组（78.84％）。其γδΤ细胞百分率高达65.98％，明显高于其他3组（6.62％、6.34％和21．01％）（P＜0.01）。

2.3γδΤ细胞、NK细胞及LAK细胞的体外细胞毒效应分析用LDH酶释放法检测γδΤ细胞、NK细胞及LAK细胞对NK敏感的细胞K562以及NK不敏感的细胞Raji和XG-7的杀伤活性。从图1的数据看到γδΤ细胞对K562、Raji和XG-73种不同的靶细胞均有较高的杀伤率，分别为35.98％、52.27％和69.08％。尤其对NK不敏感的XG-7细胞的杀伤活性明显高于其它组（P＜0.01）。

图1γδΤ细胞、NK细胞及LAK细胞的体外细胞毒效应

Fig1CytotoxinofγδTcells，NKandLAK

2.4抗MHC-Ⅰ类单抗对γδΤ细胞的体外细胞毒效应的影响结果如图2所示。经抗MHC-Ⅰ类单抗封闭前后的K562、Raji和XG-73种不同的靶细胞，γδΤ细胞对它们的杀伤率无明显差异（P＞0.05）。

图2抗MHC-Ⅰ类单抗对γδΤ细胞的体外细胞毒效应的影响

Fig2EffectofthecytotoxinofγδΤcellsbyanti-MHCAb

3讨论

过继性免疫治疗是肿瘤生物治疗的重要手段之一。自1986年ROSENBERG等首次证明荷瘤小鼠回输LAK细胞能延长小鼠存活期之后，以LAK、TIL细胞为代表的肿瘤生物治疗在临床上得到广泛应用，并取得了一定的疗效。1986年SAITO首次发现在正常外周血淋巴细胞中有一群为数只占3％～10％的γδΤ细胞，它们表达CD3^＋、CD4^－和CD8^－。

我们建立的一种快