［摘要］目的探讨ROS影响巨噬细胞凋亡的机制。方法激光扫描共聚焦显微术、流式细胞术和荧光标记技术等。结果①凋亡巨噬细胞内NADPH氧化酶活性急剧降低使得胞内ROS水平快速下降；②ROS清除剂促进地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡；③PKC促进巨噬细胞凋亡和ROS急剧减少；cAMP抑制巨噬细胞凋亡和ROS急剧减少。结论①ROS抑制地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡；②PKC、cAMP等因素通过影响地塞米松介导巨噬细胞凋亡时发生的ROS变化促进或抑制巨噬细胞凋亡。由此可见，ROS作为一种巨噬细胞的信使分子和效应分子，一方面抑制巨噬细胞自身凋亡，一方面执行巨噬细胞介导其它细胞凋亡的作用。

［中图分类号］Q28［文献标识码］A

［文章编号］1000-8861（2000）05-0334-05

Effects of ROS on apoptosis in murine peritoneal macrophage

HUANG Xing-xu，CHEN Lian-bo，MA Xiao-dong，QIAO Dong-fang，BAO Yong-yao，PIAO Ying-jie

（Central Laboratory，the First Military Medical University，Guangzhou 510515，China）

［Abstract］ObjectiveTo study the mechanisms of ROS affecting apoptosis in murine peritoneal macrophages． MethodsLaser scanning confocal microscopy，flow cytometry and fluorescence labeling were used．Results ①The activity of NADPH oxidase in apoptotic macrophages declined sharply，which resulted in rapid decrease of ROS；②ROS scavengers promoted dexamethasone induced apoptosis of macrophages；③PKC promoted，and cAMP inhibited the apoptosis of macrophages and the rapid drop in ROS．Conclusions①ROS inhibits dexamethasone induced apoptosis of macrophage；②PKC、cAMP regulate the process of apoptosis of macrophage by promoting or inhibiting changes of ROS in apoptotic macrophages． These results proved that，ROS，act both as a signal molecule and an effector of macrophages，inhibits apoptosis in themselves and mediates apoptosis in other cells．

［Key words］ROS；apoptosis；apoptosis regulation；peritoneal macrophage；LSCM

巨噬细胞受到刺激或进行吞噬作用后，发生呼吸爆发，产生大量ROS（活性氧），并通过ROS杀灭和吞噬微生物^［1］。ROS作为细胞凋亡的介导者^［2］，又是巨噬细胞在肿瘤免疫中发挥独特作用的基础。激活的巨噬细胞生成ROS、TNF-α（肿瘤坏死因子）等，通过诱导细胞凋亡的方式杀灭肿瘤细胞^［3］。由此可见，ROS是巨噬细胞实现其正常功能的主要工具之一。现在发现，机体还必须通过调控巨噬细胞自身凋亡保持巨噬细胞数量恒定^［4］。本实验利用激光扫描共聚焦显微镜可原位、实时观察活细胞变化的特点，追踪大剂量地塞米松处理诱发巨噬细胞快速凋亡过程中胞内ROS的动态变化，检测PKC、TPK、cAMP、cGMP等信使分子对巨噬细胞凋亡和ROS变化的影响，初步探讨ROS在巨噬细胞介导肿瘤细胞^［3］和其它细胞^［5］凋亡过程中调控巨噬细胞自身凋亡的机理。

1材料和方法

1．1实验材料

1．1．1实验动物：18～20 g雌性昆明小鼠。

1．1．2实验试剂：碘化丙啶（propidium iodide，PI）、巯基乙醇酸钠（thioglycolate）、HEPES（N-［2-Hydroxyethyl］、piperazine-N'-［2-ethanesulfonic acid］）、staurosporine、genistein、DcAMP（dibytyryl cyclic 3’5’-adenosine monophosphate，双丁酰环腺甘酸）、亚甲蓝（methylene blue）、过氧化物酶（catalase）、DMSO（dimethyl sulfone，二甲亚砜）购自美国Sigma公司；2'，7'-二氯荧光素二脂（2'，7'-dichlorofluorescin-diacetate，DCFH-DA）、HE（hydroethidine），购自美国Molecular Probes公司；TUNEL试剂盒、核糖核酸酶（RNase）、蛋白酶K（proteinase K），购自德国Boehringer Mannheim公司；RPMI-1640，购自德国GIBCO BRL 公司；小牛血清，购自杭州四季青生物材料厂。其它试剂均为国产分析纯。

1．2实验方法

1．2．1细胞培养：18～20 g雌性昆明小鼠，按1次／d，1 ml／次连续3 d腹腔注射1％巯基乙醇酸钠，停1 d，常规方法取腹腔巨噬细胞（台酚兰吞噬实验显示99％为巨噬细胞），以1×10⁶个／ml接种于96孔细胞培养板（Nunc，丹麦）和改装35 mm Petri皿（Meridian，美国）上，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养于37 °C，含5％ CO₂孵箱（Quene System，美国）内。12 h后加入大剂量地塞米松（1×10^－4 mol／L）处理细胞。

1．2．2细胞凋亡检测

1．2．2．1流式细胞术：按上述条件培养、处理的巨噬细胞，按每个样品1×10⁶个，用细胞刮（rubber policeman）从培养板上刮下，离心收集。按常规方法制样，PI染色，Elite流式细胞仪（COULTER，美国）采集数据（激发光波长488 nm，发射光波长633 nm），并用Multicycle分析软件分析，通过计数凋亡区（亚二倍体区）细胞数量得出凋亡率。

1．2．2．2TUNEL染色：按GAVRIELI等人的方法进行^［6］。

1．2．2．3DNA琼脂糖电泳：按MEBMER等人的方法进行^［7］。

1．2．3ROS检测：按黄行许报道呼吸爆发检测方法^［8］，细胞用ROS特异性荧光探针DCFH-DA标记，在激光扫描共聚焦显微镜（Meridian，美国）上用检测器1（激发波长：488 nm；发射波长：530 nm）检测得到反映细胞内ROS水平的规一化DCF荧光变化曲线图。

1．2．4NADPH氧化酶活性检测：按ROS检测方法进行，细胞用超氧离子特异性荧光探针HE标记后，在ACAS570激光扫描共聚焦显微镜上用检测器1检测得到反映细胞内超氧离子水平的规一化EB荧光强度变化曲线。

2结果

2．1凋亡检测结果

2．1．1出现特异性凋亡峰：流式细胞分析术分析显示，地塞米松处理巨噬细胞出现特征性的凋亡峰，计数特征性凋亡峰内的细胞数得出细胞凋亡率。统计分析结果表明：经地塞米松处理0、0.5、1．0、2．0、4．0和8．0 h巨噬细胞的凋亡率（％）分别为：0、18．0、25．5、36．3、56．4和76．1。

2．1．2DNA降解：DNA琼脂糖电泳结果如图1所示，大剂量地塞米松处理巨噬细胞0.5 h即可见到少量DNA条带，处理1．0 h后条带增多，呈现典型的梯状。随后，处理时间越长，梯状条带越明显。

图1地塞米松诱发巨噬细胞DNA梯状条带

Fig1Dexamethasone induced a DNA ladder in

macrophages

The mouse peritoneal macrophages were incubated with 1×10^－4 mol／L dexamethasone（cont：control；mark：marker）． DNA fragmentation was visualized on agarose gel electrophoresis．

2．1．3TUNEL染色阳性：TUNEL检测地塞米松处理4．0 h巨噬细胞，几乎所有细胞均为TUNEL阳性（见图2），对照细胞呈TUNEL阴性。

2．2ROS生成变化脂溶性DCFH-DA进入细胞后，被脂酶水解成DCFH，不发荧光的DCFH再被细胞内的ROS氧化成发荧光的DCF^［10］，用激光扫描共聚焦显微镜检测DCF的荧光强度显示出细胞内的ROS水平。ROS水平变化也反映细胞的呼吸爆发水平改变。地塞米松处理使巨噬细胞内的荧光强度急剧下降，加样后的100 s内，荧光强度下降到0.3，下降速度为7．0×10^－3／s，随后的160 s内荧光强度以1．125×10^－3／s下降至0.18，进入平台（见图3）。

图2巨噬细胞TUNEL染色，×200

Fig2TUNEL evidence for apoptosis in macrophages

The mouse peritoneal macrophages were incubated with 1×10^-4 mol／L dexamethasone for 4 h，then fixed and observed microscopically by TUNEL staining，×200

图3地塞米松（1×10^-4mol／L）处理巨噬细胞DCF荧光变化曲线图

Fig3Fluorescence variation curve for DCF in macrophages treated with dexamethasone（1×10^－4 mol／L）

Axis Y and X indicated normalized fluorescence and time respectively． The graph is representative of three similar experiments．<