［摘要］目的克隆人白介素-18结合蛋白（hIL-18BP）的cDNA，以研究其结构与功能的关系。方法从中国汉族人的胎盘组织中提取总RNA，以RT-PCR方法扩增出全长585个bp的IL-18BPcDNA，将其与表达载体pcDNA3连接，转化大肠杆菌DH5α，建立了hIL-18BP的cDNA克隆。结果序列分析表明，与国外文献报道的人IL-18BP的cDNA序列完全一致。结论hIL-18BP已成功地得到克隆。

［中图分类号］R392.1［文献标识码］A

［文章编号］1000-8861（2000）04-0254-03

Cloning and sequencing of human IL-18 binding protein cDNA

FU Yi，ZHAO Hui-ren，PEI Dong-sheng

（Research Center for Biochemistry and Molecular Biology，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002，China）

［Abstract］ Objective To obtain the cDNA of human interleukin-18（IL-18） binding protein（hIL-18BP） and to investigate the relationship between structure and function of hIL-18BP．Methods The total RNA was extracted from human placenta and the intact cDNA of hIL-18BP was amplified by RT-PCR．The cDNA was cloned into pcDNA3 vector and transformed into E．coli DH5α．Results The result of sequencing was completely consistent with the published hIL-18BP cDNA．Conclusion hIL-18BP cDNA has been cloned successfully．

［Key words］ interleukin-18 binding protein；RT-PCR；cDNA cloning；DNA sequencing

IL-18结合蛋白（IL-18BP）是新近发现的一种糖蛋白，系免疫球蛋白超家庭成员。1998年，AIZAWA等^［1］首先克隆了小鼠的IL-18BP的cDNA序列，又以小鼠的IL-18BPcDNA作为探针，从正常人肝脏的cDNA文库中筛选出了人的IL-18BP cDNA。其表达产物能够抑制IL-18诱导Th1等细胞产生IFN-γ、IL-8，还能降低IL-18对NF-κB的激活作用^［2］，因此，被认为是IL-18的拮抗剂。为了进一步探讨IL-18BP的结构与功能的关系及其与IL-18相互作用的机制，我们利用RT-PCR的方法首次克隆了中国汉族人的IL-18BPcDNA，并进行了序列分析。

1材料与方法

1.1主要材料新鲜的胎盘组织由徐州医学院附属医院妇产科提供；总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、质粒提取试剂盒均为Promega公司产品；E．coli菌株DH5α和质粒pcDNA3为本室保存；核酸限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ以及T4DNA连接酶均购自Promega公司。

1.2总RNA提取取液氮冻存的胎盘组织约100mg，按试剂盒说明书操作，提取总RNA。总RNA沉淀溶于100μl无核酸酶的水中，－80°C保存。

1.3引物的设计与合成根据发表的人IL-18BP的cDNA序列，设计PCR引物。上游引物：5’-gcaaagcttatgaccatgagacacaactg-3’，引入了一个HindⅢ酶切位点。下游引物：5’-gcgaattcgtcgacttaaccctgctgctgtggact-3’，引入了一个EcoRⅠ酶切位点（加下划线处为酶切位点）。引物由GIBCO BRL公司合成。

1.4RT-PCR加入总RNA20μg作为模板，上、下游引物至终浓度1μmol／L，用Promega公司的RT-PCR系统进行反转录及PCR扩增。反应条件为：94°C30s，61°C1min，68°C2min，40个循环。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

1.5cDNA的克隆及扩增PCR扩增产物经酚-氯仿抽提纯化，HindⅢ和EcoRⅠ双酶切及低熔点琼脂糖凝胶电泳回收后，用酚-氯仿抽提纯化。然后与相同酶切并经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化的pcDNA3质粒室温连接5h，用连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄青平板筛选，37°C培养过夜。利用pcDNA3中的抗氨苄青基因，筛选出阳性菌落，挑取单克隆菌落，在LB培养基中小量扩增，按Promega公司的试剂盒说明书提取质粒，酶切鉴定。

1.6hIL-18BP序列分析使用ABI377全自动序列分析仪进行测序。

2结果

2.1IL-18BP的RT-PCR产物分析将RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见一清晰特异扩增带，约600bp，其大小与理论预期值一致（见图1）。

图1电泳分析RT-PCR扩增的hIL-18BPcDNA

Fig1ElectrophoresisofRT-PCRamplifiedhIL-18BP

cDNA

1：1 kbDNAladder；2：RT-PCRamplifiedhIL-18BPcDNA

2.2人IL-18BP cDNA克隆与鉴定RT-PCR产物经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，与相同酶切的pcDNA3连接，转化E．coliDH5α，经氨苄青平板筛选得到阳性克隆，提取质粒后再经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切鉴定，可见约5kb的载体片段及600bp的插入片段（见图2）。

2．3人IL-18BP序列分析对经酶切鉴定初步确认的阳性克隆测序。结果如图3所示：其序列与已知的人IL-18BPcDNA序列^［1］一致。

图2pcDNA／hIL-18BP质粒限制性酶切图谱

Fig2RestrictionenzymemappingofpcDNA／hIL-18BP

plasmid

1：pcDNA／hIL-18BPdigestedwithHindⅢandEcoRⅠ

2：1kbDNAladder

3讨论

1995年、1996年，OKAMURA^［3］和USHIO^［4］等先后克隆了鼠和人的IL-18。IL-18是一种多效性的细胞因子，它能刺激Th1细胞分泌IFN-γ、GM-CSF和IL-2，并促进Th1细胞增殖，增强FasL介导的Th1细胞的细胞毒性及NK细胞的细胞毒作用。因而IL-18具有抗肿瘤、抗感染等作用，但在一些自身免疫性疾病中，如胰岛素依赖性糖尿病^［5］、类风湿关节炎^［6］等，IL-18的表达量显著增高，另有文献报道，IL-18还是内毒素所致肝损伤的重要诱导因子^［3］，表明IL-18参与介导了这些疾病的病理过程。而IL-18BP能抑制IL-18的这种作用，并有类似于IL-18抗体的功能。因此，IL-18BP有可能用于自身免疫性疾病及内毒素所致肝损伤的治疗。

人IL-18BP有164个氨基酸残基组成，含有一段30个氨基酸残基的信号肽及4个N-糖基化位点。鼠的IL-18BP有165个氨基酸残基组成，含一段28个氨基酸残基的信号肽及4个N-糖基化位点。两者的氨基酸序列有60.8％的同源性^［1］。人IL-18BP的基因位于染色体11q13^［2］，在人的心、肺及胎盘组织中可检测到IL-18BPmRNA的表达^［1］。考虑天然IL-18BP有较强的糖基化，故选用哺乳动物细胞质粒表达载体pcDNA3。IL-18BP的表达、纯化及生物学活性的测定将是我们下一步的工作。

NOVICK等^［7］曾报道在人的尿液中分离、纯化得到一分子量为38 kd的蛋白质，认为是IL-18的可溶性受体。经氨基酸序列分析，该蛋白就是IL-18BP。但IL-18BP无跨膜区域^［1］。而后随着IL-18受体（IL-1Rrp和AcPL）的成功克隆^［8，9］，进一步表明了IL-18BP并非IL-18的可溶性受体，而是通过与IL-18结合抑制IL-18与其受体的结合而发挥作用的蛋白质。

图3hIL-18BPcDNA的核苷酸序列

Fig3NucleotidesequenceofhIL-18BPcDNA

IL-18BP的克隆成功，有助于进一步研究IL-18BP的功能及其与IL-18的相互关系，也为IL-18BP的临床应用奠定了基础。

［作者简介］ 傅奕（1975－），女 ，江苏锡山市人，助教，硕士生，主要从事白介素等细胞因子方面的研究。

［参考文献］

［1］ AIZAWA Y，AKITA K，TANIAI M，et al．Cloning and expression of interleukin-18 binding protein［J］．FEBS Lett，1999，445（2，3）：338－342．

［2］ NOVICK D，KIM SH，FANTUZZI G，et al．Interleukin-18 binding protein：a novel modulator of the Th1 cytokine response［J］．Immunity，1999，10（1）：127－136．

［3］ OKAMURA H，TSUTSUI H，KOMATSU T，et al．Cloning of a new cytokine that induces IFN-γ production by T cells［J］．Nature，1995，378（2）：88－91．

［4］ USHIO S，NAMBA M，OKURA T，et al．Cloning of the cDNA for human IFN-γ- inducing factor，expression in Escherichia