［摘要］噬菌体呈现抗体库技术被誉为抗体技术的第三次革命，发展构建库容量大、特异性高和敏感强的人源性抗体库是噬菌体呈现技术的关键。本文就如何提高转化效益、实验策略及抗体应用的研究等方面作一综述。

［中图分类号］R392.11-33［文献标识码］A

［文章编号］1000-8861（2000）04-0309-04

Strategies for selection of human antibodies by phage display

WANG Xi-liang， HUANG Yun-hui

（Department of Immunology，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

［Abstract］ Antibody phage display technology has been described as the third revolution in antibody technology．The key of this technology was the construction of large，highly specific and sensitive antibody libraries．This review addresses recent progress in the construction，experimental approaches，and applications of human antibody phage display libraries．

［Key words］ antibody phage display libraries；gene mutation；transgene

噬菌体呈现人抗体库（humanphagedisplay）是近年发明的一项新技术，由于该技术具有生产人抗体的潜力，因此，吸引了越来越多的生命科学者投入这一研究，使得噬菌体呈现抗体库技术得以发展，由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生产路线^［1］。噬菌体呈现人抗体是单克隆抗体发展史上的里程碑，现将噬菌体呈现技术在人抗体库构建的研究策略加以综述。

1噬菌体呈现人抗体库的原理及种类

1.1原理噬菌体抗体是在膜表面表达有抗体分子Fab或ScFv，这种膜表达是通过Fab段或ScFv与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白而完成，其特点是它既可以识别相应抗原与其相结合，又能够感染宿主菌进行再扩增，将B细胞全套可变区基因克隆出来，组装成噬菌抗体的群体，则成为噬菌体抗体呈现技术^［2］。噬菌体抗体库技术的产生依赖于三项实验技术的发展：一是PCR技术的发展使人们可以用一组引物，通过RT-PCR直接从总RNA克隆出全套免疫球蛋白可变区基因，从而使抗体库的构建简单易行。二是从大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段的成功。三是噬菌体表面表达技术的建立，即将肽链通过与单链噬菌体外壳蛋白融合表达在单链噬菌体的表面。利用其可以再扩增的特性，将靶分子固相化，通过亲和吸附—洗脱—扩增，可筛选到靶分子的配体肽链。可经突变和链置换方法改进抗体亲和力，最终获得高亲和力的特异性抗体^［3］。

1.2种类根据人抗体基因的来源和组成不同可分为^［4］：①天然抗体基因库，该抗体基因片段来自于未免疫的供体。特点是该抗体库基本上代表了天然抗体在供体内的抗体谱，但亲和力较低。②免疫抗体库，抗体基因来自于经抗原免疫过的供体，特点是它具有较强的抗原特异性和亲和力，但抗体的多样性低。③半合成抗体库，抗体重链可变区基因片段中的CDR₁和CDR₂来自于人胚系49种V_H基因片段，而CDR₃则是人工合成编码5～8或6～15个氨基酸的随机引物来置换Fab抗体中Fd片段的CDR₃，构建半合成噬菌体抗体库。其特点是增大了库容量可达到10¹²，但由于该库中抗体基因没有经过体内免疫系统的选择，因此抗体的亲和力普遍较低。④转基因鼠抗体库，是把人抗体基因转入鼠，获得完全的人抗体，解决了鼠源性问题，将是今后人源性抗体研究和应用的发展方向。

2噬菌体人抗体库的构建

2.1扩增人抗体Fab基因片段取业已经抗原接种或被免疫的人外周血淋巴细胞、脾、扁桃腺、淋巴结组织或骨髓细胞，提取总RNA或基因组DNA。理论上每个静止期B细胞可产生100个拷贝的IgmRNA，而增殖期的浆细胞可产生300个。因此，免疫接种可明显提高IgmRNA及编码抗原结合部位V区基因的数量。通过RT-PCR扩增获得建库所需的全套抗体基因。抗体基因扩增的5’端引物的设计通常是根据成熟抗体V区外显子的框架1区（FR1）或前导区的保守序列，3’端主要依据抗体绞链区（J区）的保守序列。依据各种抗体基因家族序列而设计一组引物，分别对抗体cDNA或DNA扩增后，再将扩增产物予以混合。有时还采用简并引物扩增，以获得引物与模板间的最大互补性^［5］。若制备ScFv抗体基因片段，须设计接头（linkers）DNA，如［Gly₄-Ser］₃的编码寡核苷酸，制备V_H-linker-V_L基因连接物，进行下一步的基因克隆与表达。

2.2人抗体基因的克隆噬菌体抗体库技术使用的载体都是在已有的噬菌粒基础上进行改建的，这些载体除含有LacZ启动子、核糖体结合位点、pe1B前导序列及供外源基因插入的多克隆位点外，还含有丝状噬菌体M₁₃的外壳蛋白基因。pcomb₃是一个噬菌体建库所需的常用载体，它是由Lerner小组在1991年构建而成，是将Huse1989年构建的λHC₂和λLC₂的两个λ载体经Sac1和EcoR₂双酶切，连接后成为pcomb₃组合噬菌体载体。pcomb₃除保留了原载体中的pelB前导序列和供外源基因插入的多克隆位点外，还引入来自M₁₃ Mp₁₈噬菌体LacZ启动子、操纵子及用于控制轻链基因的帽子结合位点等，进一步拼接编码M₁₃噬菌体外壳蛋白的gⅢ基因，并在克隆位点上加来自于pbluescript的填充片段即构成了4029bp的pcomb₃。使用这些载体构建抗体基因库时，获得的全套重链抗体基因与轻链基因以适当的内切酶消化后，克隆进载体相应酶切位点。克隆的方法一般先克隆一类抗体基因，然后再克隆另一类抗体基因，经过随机重排组合将这些基因插入到噬菌体或噬粒表达载体多克隆位点中，所克隆进载体中的重、轻链基因间的配对也存在着很大的随机性，这就进一步丰富了抗体库的内涵，增加了抗体库的多样性。

2.3表达人抗体基因在噬菌体抗体库中，由于克隆抗体基因的载体中引入了M₁₃噬菌体外壳蛋白基因，使得抗体与噬菌体外壳蛋白基因融合，并借助外壳蛋白而呈现在噬菌体颗粒的表面。pcomb₃构建的噬菌体Fab抗体与噬菌体gⅢ基因融合的抗体重链Fd基因和轻链（κ或λ）基因，由于分别置于各自的LacZ启动子、操纵子序列的控制下进行表达，故能借助于噬菌体外壳蛋白基因中的pelB前导序列各自进入细菌的质周腔中，在此完成重链、轻链的自发折叠而形成Fab抗体（Fd＋κ或λ）。pelB前导序列在进入质周腔前被切下去，而质周腔中的Fab抗体则借助重链与cpⅢ形成的融合分子锚定在细菌内膜上，经辅助噬菌体（如VCSM₁₃）感染后，Fab抗体便被包装入噬菌体内，借助于cpⅢ而呈现在噬菌体表面。由于噬菌体还含有天然的cpⅢ蛋白，可以再次感染宿主菌，故抗药噬菌体菌落即为重组成功的噬菌体，形成含有全套人抗体谱的噬菌体抗体文库，库中每一个噬菌体相当于B细胞表达一种特异人单克隆抗体，而多个噬菌体的集合则成为多克隆抗体。利用噬菌体表面的Fab抗体对抗原的结合活性及噬菌体对宿主菌的感染性，可以用固相化抗原方便地对噬菌体抗体库进行淘筛。

除了呈现在噬菌体表面外，Fab抗体还能以可溶性抗体的形式进行表达^［6］。Lerner小组在构建pcomb₃载体时，将噬菌体外壳蛋白gⅢ基因（或gⅧ基因）的两端设计了spe1和Nhe1两个酶切位点，通过这两个内切酶即可将外壳蛋白基因切除，利用Spe1和Nhe1酶解后产生的互补粘性端，自连后成为环状质粒，转化宿主菌并经IPTG诱导即在细菌的质周腔或培养上清液中得到Fab抗体。Winter小组则采取另一种技术路线解决了这一问题，他们在构建噬菌体抗体载体时，在抗体基因与gⅢ基因之间引入了一个琥珀终止密码子，抗体基因的重组子若转化含有琥珀抑制基因XLBlue的宿主菌，抗体基因和gⅢ基因成为一个开放阅读框架，这时抗体就能借助噬菌体外壳蛋白cpⅢ而呈现在噬菌体表面。如将重组子转化不带有琥珀抑制基因HB₂₁₅₁的宿主菌，由于抗体基因与gⅢ基因之间的终止密码子抑制了gⅢ基因的表达，便产生可溶性的Fab抗体。

2.4筛选特异性人抗体片段在人体内B淋巴细胞在抗原提呈作用下，增殖分化为分泌抗体的浆细胞，并在抗原的选择压力下发生突变，产生出具有不同亲和力的抗体。噬菌体呈现抗体库技术模拟了机体免疫系统的这种选择作用，呈现在噬菌体表面的抗体能够在体外用固相化抗原进行筛选，同时由于噬菌体对大肠杆菌的感染性，噬菌体抗体库技术能够以淘筛的方式，为快速选择特异性抗体提供了简便而高效的操作系统，具体的步骤：①噬菌体吸附靶抗原。②反复洗涤去除非特异性结合。③洗脱并收集与抗原结合的噬菌体。④再次感染大肠杆菌，使特异的噬菌体抗体淘筛。经过一轮这样的“吸附—洗脱—扩增”的淘筛，可使特异性抗体的噬菌体富集20～1000倍，若每一轮淘筛只按50倍的富集率计算，经过4轮淘筛，可使噬菌体抗体的富集率达10⁸以上，筛选出占库容量仅为1／10⁸的噬菌体抗体，噬菌体抗体库技术借助这种高效筛选系统，能够方便地对库容量在10⁸以上的抗体进行筛选，这种极强的筛选能力是早期的抗体库技术所望尘莫及的^［7］。除此之外，也有用固相淘筛、捕获淘选、完整细胞淘筛、组织淘筛及器官淘筛等