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［中图分类号］R392.11［文献标识码］A
［文章编号］1000-8861（2000）04-0304-05
Cloning and expression and polyclonal antibody preparation of human FasL
WANG Hua， GAO Jie-ying， LIU Yong-quan， PENG Hong， LUO Zhen-ge
（Institute of Microbiology and Epidemiology，Academy of Military Science， Beijing 100850， China）
［Abstract］ Objective The study is aimed at obtaining FasL protein and doing some research about its function． Me-thods We constructed E．coli expressed vector pGEX-KG-hFL， and FasL cDNA fused to the 3’end of the gene encoding the GST protein． The fusion protein was expressed in E．coli JM109 at 37 °C after 0.2 mmol／L IPTG induction for 3 hours． Inclusion bodies dissolved in the solution of 8 mol／L urea were used as immunogen to prepare the polyclonal antibody． Results The fusion protein of high expression has a molecular weight of 46 kd by SDS-PAGE． The yield of the FasL fused protein was 20 percent in total proteins． We observed that the polyclonal antibody can recognize fusion protein and GST by immunoblotting． Conclusion The successful expression of FasL fusion protein and preparation of polyclonal antibody will provide material for further studies of FasL．
［Key words］ FasL； fusion protein； E．coli expression； polyclonal antibody
FasL（fasligand）分子属于肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）超家族成员，为Ⅱ型跨膜糖蛋白。其相应的受体为Fas（CD95），FasL可以传达死亡信号给Fas从而诱导细胞凋亡。FasL分子在一系列生理和病理反应中发挥重要作用。如参与T、B淋巴细胞的克隆选择；介导细胞毒T细胞（CTL）对靶细胞的杀伤作用；参与免疫耐受的形成等。FasL作为Fas系统的一个重要成员日益受到人们的重视。目前国外对于人和鼠的FasL分子的研究已较为深入，主要集中在FasL与疾病的关系及其在疾病治疗中所起的作用。而国内的研究则多局限在检测疾病过程中FasL分子的异常表达方面，而且至今尚无其表达成功的报道。本研究从人FasL分子入手，获得了该分子的胞外区cDNA，利用原核融合蛋白表达系统得到重组hFasL胞外区蛋白的表达，对重组产物进行了初步纯化和鉴定，制备了相应的多克隆抗体，为我们今后进行Fas／FasL系统的研究做了必要的准备。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1细菌菌株和质粒载体：E．coliJM109等菌株及pUC-18和pGEX-KG等质粒由本室保存，pBX-hFL质粒由日本东京大学郭卯戊博士惠赠。
1．1．2酶及其它试剂：TaqDNA聚合酶，限制性内切酶SalⅠ和EcoRⅠ，T4DNA连接酶等购自原平生物工程公司及华美生物工程公司；生物素标记羊抗兔IgG，亲和素标记HRP，生物素标记蛋白质标准分子量等均由本室制备。
1．1．3实验动物：日本大耳白家兔，2～2．5kg，雄性。由本院动物中心提供。
1．2方法
1．2.1PCR引物设计：按照引物设计原则，根据人Fas LigandcDNA序列［1］并按构建融合蛋白pGEX-KG表达载体的要求，设计一对引物（由上海生物工程公司合成）用于扩增人FasL胞外区，利用PCRDESN软件分析两条引物间的配对情况，基本符合PCR引物的要求。上游引物primer1：5’-GCGAATTCAGCTCTTCCACCTACAGAAG-3’下游引物primer2：5’-GCGTCGACTTAGAGCTTATATAAGCCG-3’。primer1引入EcoRⅠ酶切点，primer2引入SalⅠ酶切点，此对引物应能扩增出编码人FasL分子胞外区的DNA片段。
1．2.2目的片段的扩增：以pBX-hFL质粒为模板进行PCR扩增，反应条件是94°C1min，46°C1min，72°C1．5min，进行5个循环；94°C1min，72°C2min共进行25个循环，最后在72°C延伸10min。取5μl反应液在1％琼脂糖凝胶电泳上进行扩增产物检测分析。
1．2．3DNA片段的回收和纯化：将扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳后切下含目的片段的胶块，－20°C置30min，12000g4°C离心5min，取上清，加入1／10体积3N的NaAC及2倍体积的无水乙醇，0°C下放置20min后，12000g4°C离心5min，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，弃上清，真空抽干。沉淀溶于TE中，进行定量分析，－20°C储存备用。
1．2．4pUC-18-hFL重组质粒的构建：PCR扩增目的片段和pUC-18载体用EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切，用T4 DNA连接酶进行连接。采用碱裂解法小量快速抽提质粒DNA，以pUC-18空载体的迁移距离为标准，筛选滞后的重组子。并以EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切进行鉴定。
1．2.5DNA序列测定：由大连宝生物公司自动测序仪（ABI PRISMTM 377 DNASequencer）测定。
1．2．6表达载体的构建与鉴定：以EcoRⅠ／SalⅠ双酶切从重组克隆载体pUC-18-hFL分离目的片段，回收纯化后与经相同酶切的pGEX-KG载体相连，得到重组表达载体pGEX-KG-hFL。采用碱裂解法小量快速抽提质粒DNA，以pGEX-KG空载体的迁移距离为标准，筛选滞后的重组子。再以EcoRⅠ／SalⅠ双酶切作进一步鉴定。
1．2.7pGEX-KG-hFL融合蛋白的诱导表达：挑取新鲜的含重组质粒pGEX-KG-hFL的大肠杆菌JM109单菌落及含空载体质粒的对照JM109单菌落置4mlLB培养液中（含Amp100μg／ml），37°C振摇过夜，次日将饱和菌液以1∶200的稀释度加入4mlLB培养液中37°C振摇3h后加入IPTG至终浓度0.2mmol，37°C继续振摇3h进行诱导后，12000g离心5min，取沉淀悬于100μlTE溶液中备用［2］。
1．2.8重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳：将菌体沉淀各取20μ1，加入等体积的2×样品处理液，100°C加热5min，进行SDS-PAGE电泳，样品胶为4％，分离胶12.6％，稳定电压140V直至溴酚蓝染料跑至胶底，取出凝胶用考马斯亮兰染色15min，然后脱色至背景清晰。
1．2.9表达蛋白的纯化：200ml菌体培养液离心收集菌体，用PBS（pH7.0）洗涤2次，30mlTris缓冲液（1mmol／LMEDTA，pH7．0）悬浮菌体，超声破碎后于4°C12000g离心10min，收集沉淀，进行包涵体的初步纯化：将沉淀用5ml含1％ Triton-100的2mol／L和4mol／L尿素各洗涤1次，最后用含1mol／LDTT的8mol／L尿素悬浮沉淀，37°C温浴10min，于室温12000g离心20min后收集上清，即为初步纯化的重组蛋白。纯化过程中每一步收集的上清各取20μ1加等体积的2×样品处理液，沸水浴5min，进行SDS-PAGE电泳。
1．2.10多克隆抗体的制备：按常规方法进行。8mol／L尿素溶解的包涵体进行SDS-PAGE电泳后根据蛋白Marker切下目的融合蛋白冷冻干燥，研磨成粉末，免疫前以无菌PBS溶解，和等体积弗氏完全佐剂充分混合，皮下多点注射家兔，每只家兔融合蛋白的用量为180μg；每间隔2周加强免疫1次，共加强4次，每次免疫的剂量同上，从第3次免疫后1周开始测定血清抗体效价，末次免疫后2周心脏采血。分离血清，取部分进行纯化，制备IgG，分装置－20°C保存。
1．2.11WesternBlot检测hFasL融合蛋白免疫学活性：将重组菌菌体蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳，然后进行蛋白质电转移，将蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜上（滤膜孔径0.3μm，转移条件为400mA转印40min）。用制备的兔抗人FasL多抗与膜上的蛋白进行抗原-抗体反应，用生物素-亲和素标记系统进行检测，DAB（0.6mg／ml）显色，至目的条带染色清晰时终止反应。
2结果
2.1PCR扩增hFasLDNA片段用设计的两条引物从pBX-hFL质粒上扩增出了540bp大小的DNA片段，与预期分子量大小相符（见图1）。
2.2重组质粒的构建及鉴定采用pUC-18克隆载体系统（见图2）。将以EcoRⅠ／SalⅠ双酶切的540bp产物与pUC-18载体相连，转化大肠杆菌JM109，进行重组克隆的筛选，碱裂解法小量制备阳性克隆株质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小，用蓝斑质粒作为对照，可见重组质粒明显大于对照组质粒。用SalⅠ单酶切，重组质粒酶切产物在3．2kb处出现条带。用EcoRⅠ／SalⅠ双酶切鉴定，重组质粒酶切产物分别在540bp和2．7kb处出现条带（见图3）。
