［摘要］目的研究白介素-1受体相关激酶-1（IRAK-1）和IRAK-2在白介素-1（IL-1）诱导AP-1活化中的作用。方法Lipofectin介导反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸转染HepG2细胞。用逆转录PCR法检测IRAK-1和IRAK-2 mRNA表达水平；Westernblot分析IRAK-1和IRAK-2蛋白表达水平。以SandwichELISA法检测AP-1的活化。结果反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸通过抑制各自靶基因mRNA和蛋白表达抑制IL-1诱导的AP-1活化；反义IRAK-1寡核苷酸与反义IRAK-2寡核苷酸共转染HepG2细胞对AP-1的抑制作用较两者单独转染明显增强。结论IRAK-1和IRAK-2在调控白介素-1诱导的AP-1活化时协同作用。

［中图分类号］R392.11［文献标识码］A

［文章编号］1000-8861（2000）04-0250-04

IL-1 receptor associated kinase-1 and -2 synergistically activate AP-1

GUO Fu-kun， WU Shu-guang

（Institute of Pharmaceutic Sciences， the First Military Medical University， Guangzhou 510515，China）

［Abstract］ Objective To investigate whether interleukin-1 receptor associated kinase-1 （IRAK-1） and IRAK-2 are functionally combined or redundant but differentially expressed in interleukin-1（IL-1）-induced activator protein-1（AP-1） activation． Methods Phosphorothioate oligonucleotides（ODN） were designed antisense to sequences of IRAK-1 or IRAK-2． Antisense IRAK-1 ODN or antisense IRAK-2 ODN was delivered by lipofectin encapsulation into cultured HepG2 cells． IRAK-1 and IRAK-2 mRNA expression were assayed by semiquantitative reverse transcription-PCR． IRAK-1 and IRAK-2 protein expression were detected by western blot． The levels of activator protein-1（AP-1） were measured by sandwich ELISA． Results Antisense IRAK-1 ODN and antisense IRAK-2 ODN blocked IRAK-1 and IRAK-2 expression， respectively． As a result， antisense IRAK-1 ODN or antisense IRAK-2 ODN inhibited IL-1-induced AP-1 activation． Cotransfection of antisense IRAK-1 ODN 4 μg with antisense IRAK-2 ODN 4 μg resulted in an additive inhibition of AP-1 activation． Conclusion IRAK-1 regulates IL-1-stimulated AP-1 activation in cooperation with IRAK-2．

［Key words］ interleukin-1； interleukin-1 receptor associated kinase； antisense oligonucleotide； activator protein-1

白介素-1（IL-1）是在免疫和炎症反应中起核心作用的细胞因子。越来越多的研究表明：IL-1的生物学效应主要由转录因子核因子-κB（NF-κB）和AP-1调控^［1，2］。因此，阐明IL-1活化NF-κB和AP-1的机制具有重要的理论和临床应用价值。IL-1刺激信号由其I型受体（IL-1RI）转导。与大多数细胞因子受体不同，IL-1RI没有内在的蛋白激酶活性^［3］，因而势必需要结合细胞浆蛋白激酶来传导信号。IL-1受体相关激酶-1（IRAK-1）和IRAK-2就属于这样的蛋白激酶^［4，5］。IRAK-1和RAK-2都能通过下游的肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）激活NF-κB和AP-1^［5，6］。我们最近的研究表明：IRAK-1和IRAK-2在调控NF-κB活化时协同作用，但是，目前还不清楚它们是否协同调控AP-1活化，本文对此进行了探讨。

1材料与方法

1.1细胞系和试剂人肝癌细胞系HepG2细胞从ATCC公司购买；DMEM和lipofectin从GibcoBRL公司购买。IL-1β由北京邦定生物医学公司提供。山羊c-Fosp62特异性抗体（抗原表位相应于人源c-Fosp62N端）、兔c-Fosp62 特异性抗体（抗原表位相应于人源c-Fosp62 C端）和山羊IRAK-1特异性抗体由美国SantaCruZ生物技术公司生产。山羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG购自河南华美生物工程公司。SV总RNA分离试剂盒和逆转录-PCR（RT-PCR）试剂盒为Promega公司产品。兔IRAK-2特异性抗体由美国MMRTA MUZIO博士惠赠。

1.2方法

1.2.1细胞培养：HepG2细胞用含10％小牛血清的DMEM培养基于37°C，5％CO₂条件下培养至汇合成片。

1.2.2寡核苷酸的序列及合成：反义IRAK-1寡核苷酸序列：5’-CCCCCCGGCCATGGCTGC-3’；正义IRAK-1寡核苷酸序列：5’-GCAGCCATGGCCGGGGGG-3’。反义IRAK-2寡核苷酸序列：5’-GTAGATGTAGCAGGCCAT-3’；正义IRAK-2寡核苷酸序列：5’-ATGGCCTGCTACATCTAC-3’。寡核苷酸由上海生工生物工程有限公司合成。寡核苷酸的5’端和3’端各3个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰。正义寡核苷酸序列与靶序列一致。反义寡核苷酸序列与靶序列互补。

1.2.3Lipofectin包裹寡核苷酸的制备：参照lipofectin说明书操作。

1.2.4RT-PCR法测定IRAK-1和IRAK-2 mRNA表达：汇合成片的HepG2细胞用IL-1β100U／ml刺激30min，洗去IL-1β，IRAK-1实验组分别加入正义IRAK-1寡核苷酸4μg和反义IRAK-1寡核苷酸4μg；IRAK-2实验组分别加入正义IRAK-2寡核苷酸4μg和反义IRAK-2寡核苷酸4μg，各实验组均设立对照。细胞与寡核苷酸孵育8h，提取总RNA，RT-PCR扩增。扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳并用BIO-PROFIL／BIO-CAPT／BIO-1D＋＋图像分析软件（VILBER LOURMAT公司）定量。IRAK-1 5’端引物为：5’-ACTTCTTGTACGAGGTGCCGCC-3’；3’端引物为：5’-GGGCAGGCCTGGGTCTGGCAGT-3’。IRAK-2 5’端引物为：5’-CTGAGGATGAACAGGAAGAGG-3’端引物为：5’-CCAGCACAGGTAAGACATTGG-3’。内参照β-actin5’端引物为5’-TGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’；3’端引物为5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’（由上海生工生物工程有限公司合成）。重复实验3次。

1.2.5Western杂交分析IRAK-1和IRAK-2蛋白表达水平：细胞用IL-1β和寡核苷酸处理的条件同1.2.4。细胞与寡核苷酸孵育8h后，洗去寡核苷酸，进行Western杂交^［7］并用BIO-PROFIL／BIO-CAPT／BIO-1D＋＋图像分析软件（VILBER LOURMAT公司）定量。重复实验3次。

1.2.6SandwichELISA法测定AP-1：按ROVIN等人的方法提取细胞核蛋白^［8］，用SandwichELISA法测定AP-1^［9］。重复实验3次。

1.2.7数据分析：实验数据以±s表示，采用t检验进行统计学分析。

2结果

2.1反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别对IRAK-1和IRAK-2mRNA表达的影响以IRAK-1和IRAK-2 PCR产物与作为内参照的看家基因β-actinPCR产物吸收峰体积的比值反映反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸对各自靶基因表达的影响。结果表明：反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别抑制IRAK-1和IRAK-2 mRNA表达（与对照组相比，P＜0.01），而正义IRAK-1寡核苷酸和正义IRAK-2寡核苷酸都不能抑制靶基因表达（见图1）。

图1A：反义IRAK-1寡核苷酸对IRAK-1 mRNA表达的影响（与对照组比较，P＜0.01）；B：反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2mRNA表达的影响（与对照组比较，P＜0.01）

Fig1A：effectofantisenseIRAK-1ODNonIRAK-1mRNAexpression（comparedtocontrol，P＜0.01），B：effectofantisenseIRAK-2ODNonIRAK-2mRNAexpression（comparedtocontrol，P＜0.01）

S-1：senseIRAK-1ODN，S-2：senseIRAK-2ODN，AS-1：antisenseIRAK-1ODN，AS-2：antisenseIRAK-2ODN，bp：basepair，V：volumeofpeak

2.2反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别对IRAK-1和IRAK-2蛋白表达的影响Western杂交分析结果显示：反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别抑制IRAK-1和IRAK-2蛋白表达，抑制率分别为71.8％±4．2％和45％±6．1％。正义IRAK-1寡核苷酸和正义IRAK-2寡核苷酸无抑制作用（见图2）。

图2A：反义IRAK-1寡核苷酸对IRAK-1蛋白表达的影响；B：反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2蛋白表达的影响

Fig2A：effectofantisenseIRAK-1ODNonIRAK-1proteinexpression，B：effectofantisenseIRAK-2ODNonIRAK-2proteinexpression

S-1：senseIRAK-1ODN，S-2：senseIRAK-2ODN，AS-1：antisenseIRAK-1ODN，AS-2：antisenseIRAK-2ODN，C：control

2.3反义IRAK-1寡核苷酸对AP-1活化的影响汇合成片的细