［摘要］目的探讨细胞内细胞色素氧化酶p450（CYP）表达、视黄酸（RA）代谢与细胞凋亡的相互关系。方法采用脂质体介导的质粒转染和逆转录-PCR等实验技术方法做有关分析检测。结果野生型HL-60细胞hp450RAI表达微弱，脂质体介导的hp450RAI质粒转染可使HL-60细胞稳定表达hp450RAI；hp450RAI转染对ATRA诱导的HL-60细胞增殖能力无明显影响；野生型HL-60细胞有较强Bcl-2表达，ATRA处理抑制未转染细胞Bcl-2表达，但单纯hp450RAI转染、hp450RAI转染＋CYP抑制剂或加用IFN-α均能增强Bcl-2表达，其中以加用ketoconazole作用更为显著。结论RA敏感HL-60细胞中影响RA代谢的主要CYP并非hp450RAI，hp450RAI转染能增强Bcl-2表达，但对HL-60细胞增殖能力无明显影响，CYP抑制剂、IFN-α可能通过抑制细胞内RA代谢，而增加HL-60细胞Βcl-2表达。

［中图分类号］R733．71［文献标识码］A

［文章编号］1000-8861（2000）04-0261-04

Effects of human cytochrome p450 enzyme gene （hp450RAI） transfer into HL-60 cells on apoptosis induced by retinoic acid

WEI Na，MI Man-tian，ZHANG Qian-yong，ZHU Jun-dong，HUANG Ji-ming，YANG Zhen-zhou

（Department of Nutrition and Food Hygiene，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

［Abstract］ Objective To investigate the relationship of human cytochrome p450 enzyme gene（hp450RAI） expression，retinoic acid metabolism and cell apoptosis in HL-60 cell．Methods The plasmid transfer mediated by liposomal transfectin reagent and reverse transcription-PCR analysis were used in this study．Results The hp450RAI mRNA was weakly detected in wild HL-60 cells，but the gene transfer made the HL-60 cells express hp450RAI greatly．The hp450RAI gene transfer could not affect the growth of HL-60 cells induced by ATRA，Bcl-2 gene was expressed obviously in HL-60 cells，ATRA treatment could inhibit its expression，but hp450RAI transfer，and combined with the ketoconazole or IFN-α increased the Bcl-2 mRNA in ATRA treated HL-60 cells．Conclusion hp450RAI may not be the main cytochrome p450 enzyme which modulates the metabolism of retinoic acid in wild HL-60 cells．hp450RAI transfer into HL-60 cells can not affect the cellular proliferation，but Bcl-2 expression can be changed by the hp450RAI transfer，cytochrome enzyme inhibitor or IFN-α in HL-60 cells．

［Key words］ gene transfection； cytochrome p450 enzyme； retinoic acid metabolism； Bcl-2 expression； leukemic cells

视黄醇类化合物（retinoids）具有广泛的生物化学功能，其在调节细胞分化、生长和形态发生等方面起重要作用。一系列的研究证实，作为维生素A活性代谢物的视黄酸（retinoicacid，RA）能够抑制多种肿瘤细胞增殖、诱导其分化成熟和细胞凋亡的发生，近年来RA已被广泛地用于多种实体瘤肿瘤和白血病、尤其是人急性早幼粒细胞白血病（APL）的诱导分化治疗^［1～3］。但研究发现，用全反式视黄酸（ATRA）治疗APL完全缓解时间短，复发病人很难用ATRA重新使病人获得缓解，即存在RA抗性。RA抗性机制还不太清楚，但许多研究表明ATRA代谢加快致使细胞内RA有效浓度降低可能是其主要原因之一^［4，5］。本研究通过将一种重要的人细胞色素氧化酶p450（CYP）基因转导入HL-60细胞，使其在HL-60细胞稳定表达，进而观察其细胞内RA代谢、细胞增殖功能及凋亡抑制基因Bcl-2表达的影响，旨在深入揭示RA调节细胞功能的分子机制。

1材料与方法

1.1试剂DOTAP转染试剂盒、质粒DNA快速抽提试剂盒、DNA片段快速回收试剂盒、Tripure^TM分离试剂、Dig标记试剂盒均为宝灵曼公司产品；Rnase抑制剂、Oligd（T）18、Taq酶、M-MLV逆转录酶、dNTP、Dig标记试剂盒均为宝灵曼公司产品；LambdaDNA／EcoRⅠ＋HindⅢmarker为Sangon公司产品；全反式视黄酸（all-tranretinoicacid，ATRA）、TPA、ketconale（细胞色素氧化酶特异性抑制剂）购自Sigma公司；pcDNA3．1（＋）／hp450RAI质粒由PETKOVICH教授惠赠；人重组IFN-α购于深圳先科制药有限公司。

1.2主要仪器CO₂孵箱，FarstarPlus流式细胞仪，PTC-100多功能PCR仪（MJResearch，Inc），紫外透照仪及一次成像系统。

1.3细胞株的培养与质粒的提取、鉴定HL-60（人早幼粒细胞白血病）细胞株由中国科学院上海细胞所提供。细胞在含10％热灭活小牛血清的RPMI1640培养液中常规传代。将pcDNA3．1（＋）／hp450RAI质粒转入大肠杆菌中扩增， 而后用宝灵曼公司质粒提取试剂盒提取质粒，测量质粒浓度、纯度，行酶切鉴定。

1.4脂质体介导的质粒转染取质粒溶液（hp450RAI浓度为0.2378μg／μl）25μl（相当于hp450RAI质粒5μg）进行转染试验，详细步骤参见转染试剂盒。转染HL-60细胞（细胞密度为1．8×10⁵个／ml）37°C，5％CO₂培养48h，细胞生长接近融合时1∶4传代，当细胞生长至70％融合时600μg／mlG418加入培养液中进行筛选。同时，以相同剂量G418处理未转染细胞和空载体对照组细胞6d后，对照组及空载体组细胞均死亡，将G418浓度降至200μg／ml维持筛选。

1.5细胞增殖能力的测定实验设hp450RAI转染组（简称p450组）、hp450RAI转染组＋ketconale组（简称p450＋Ket组，ketoconazole终浓度为10nmol／L）、hp450RAI转染组＋IFN-α（简称p450＋IFN组，IFN-α终浓度为2000U／ml）、未转染组和空载体组，取2．5×10⁵个／ml细胞悬液加入到96孔培养板中，以上各组均以2．5×10^－7mol／LATRA处理3d，同时设未处理组对照。以台盼蓝染色后计数活细胞数。

1.6RNA提取与纯度鉴定pcDNA3．1（＋）／hp450RAI质粒转染并经G418筛选获得稳定表达的HL-60细胞，一定剂量ATRA、Ketconale和IFN-α处理3d后，用Promega公司Tripure^TM分离试剂提取3×10⁶～5×10⁶个细胞总RNA，详细步骤参见试剂盒说明书。以紫外分光光度计检测RNA含量及OD₂₆₀／OD₂₈₀比值，RNA保存于－70°C备用。

1.7hp450RAImRNA的检测

1.7.1探针制备：pcDNA3．1（＋）／hp450RAI质粒由PETKOVICH教授惠赠，目的片段长1741bp，质粒有一个EcoRⅠ酶切位点和一个Xhol位点。大肠杆菌新鲜感受态细菌的制备、质粒转化均参照《分子克隆实验指南》第2版所述方法，质粒提取、目的片段的回收按试剂盒说明书进行。酶切结果显示1．741kb和3．659kb两条带，其1．741kb条带为hp450RAI目的片段。

探针标记及标记效率检测：均按地高辛标记及检测试剂盒（BoehringerMannheim公司）说明进行，其标记效率为35ng／μl。

1.7.2原位分子杂交：参照蔡文琴等主编的《实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术》所述方法。阴性对照实验：杂交液中不加探针进行原位杂交。

1.8逆转录及PCR扩增

1.8.1逆转录：上述方法提取的总RNA 3μg65°C、5min后加入RNA酶抑制剂、dNTP、Oligd（T））及逆转录酶，反应总体为20μl，37°C、1h进行逆转录，70°C、10min灭活逆转录酶。

1.8.2PCR扩增引物：bcl-2：上游引物为5’-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3’，下游引物为5’-TCACTTGTGGCTCAGATAGG-3’，扩增片段280bp；内参照人β-actin扩增引物：上游引物为5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’，下游引物为5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTC-CG-3’，扩增片段348bp。

1.8.3PCR扩增条件：反应总体积50μl，加入膜板DNA0.75 μg，待扩增片段上游和下游引物终浓度为0.3μmol／L，95°C、变性5min后加5．0UTaqDNA聚合酶。扩增β-actin反应参数为94°C、1min，60°C、1min，72°C、2min，共30个循环，最后一个循环后72°C延伸10min；bcl-2片段反应参数为94°C、1min，60°C、1min，72°C、2min，共35个循环，最后一个循环后72°C延伸10min。取4μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查有无特异扩增带。

2结果

2.1转染细胞的筛选与鉴定图1为hp450RAI质粒酶切图谱。采用脂质体介导的质粒转染技术将hp450RAI质粒转导入HL-60细胞内，经G418筛选3周后获得稳定表达细胞，进而以hp450RAIcDNA为探针做原位分子杂交检测，测定转染及未转染细胞hp450RAImRNA表达，结果显示：转染细胞有较强的hp450RAI表达（见图2），而未转染细胞在本实验条件仅有弱的hp450RAI表达。