［摘要］目的探讨E．coli DNA抗肿瘤免疫的效果及免疫作用机制。方法纯化提取大肠埃希菌染色体DNA（E．coli DNA）进行抗肿瘤治疗及免疫学指标测定。结果E．coli DNA体内多种途径给药均可抑制肿瘤生长，增强正常小鼠NK细胞杀伤活性，在荷瘤小鼠亦测出NK／MΦ细胞的杀伤活性增强，对荷瘤所致的NK细胞功能下降有提高作用，还可诱生荷瘤小鼠体内γ-IFN，调节其TNF-α水平。结论E．coli DNA具有抗肿瘤免疫特性，为微生物DNA制剂开发应用于抗肿瘤治疗提供了科学依据。

［中图分类号］R730.51 ［文献标识码］A

［文章编号］1000-8861（2000）04-0278-05

Experimental study on antitumor immunity with chromatic DNA fraction from E．coli

ZHAO Yue，JIANG Fang，ZHANG Zhuo-ran

（Department of Medical Microbiology，Dalian Medical University，Dalian 116027，China）

［Abstract］ Objective To investigate the effects of Escherichia coli（E．coli）on antitumor in vivo and the mechanism．Methods The chromatic DNA purified from Escherichia coli（E．coli）was used in the experiments of antitumor in vivo．Results E．coli DNA exerted strong antitumor activity against tumors by various ways．These were further verified by the pathological section of the tumor tissue with different degree of the necrosis areas．The primary study on immunity mechanism of antitumor activity of E．coli DNA augmented NK and MΦ cells activity．E．coli DNA can induce the production of γ-IFN and regulate the level of TNF-α．Conclusion E．coli DNA can be used on immunotherapeutic treatment of tumors．

［Key words］ bacterial DNA；tumor；immunotherapy

DNA是一种带有遗传信息的大分子，不同物种的DNA其免疫原性不同^［1，2］。大肠埃希菌（E．coli）是一种肠道正常寄生菌，一般情况下不致病。纯化提取其染色体DNA（E．coli DNA）进行体内抗肿瘤治疗的动物实验，证实经多种治疗途径（SC，IL，IP）均具有抑瘤作用，并探讨其免疫作用机制，为细菌DNA疫菌应用于抗肿瘤免疫治疗增添新内容。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种：大肠埃希菌（ATCC 25922），本室保存。

1.1.2动物：纯系BALB／C小鼠，6～8周龄，体重18～20g，雌雄各半，由大连医科大学动物中心提供。

1.1.3瘤株：小鼠腹水型肝癌株（HCaF16A₃），Yac-1，J62，Hela肿瘤细胞。

1.1.4主要试剂：MTT试剂（FLUKA，瑞士），人γ-IFNELISA检测试剂盒（Genzyme，美国），人TNF-α ELISA检测试剂盒（北京邦定生物医学公司）。

1.2方法

1.2.1E．coli DNA的提取与鉴定：与溶菌酶（1mg／ml），10％SDS（1％）裂解菌体，饱和酚抽提去除菌体蛋白，透析，紫外分光光度计754测定OD_260／280比值约为1.836；薄板层析显示E．coli DNA点样处未见脂多糖存在。可认为获得纯化E．coli染色体DNA。

1.2.2荷瘤小鼠模型的建立：于小鼠右腋皮下接种HCaF16A₃，10⁶／0.2ml／只。

1.2.3E．coli DNA体内抑制率的测定：瘤内局部注射（IL）方案：将荷瘤小鼠随机分3组：TES组、BCG组、DNA组，于接种后第4d，分别瘤内注射TES液、BCG液（0.25mg／ml）、DNA液各0.3ml，隔日1次，共8次，末次注射24h后，各组小鼠分别取血、脾脏、腹腔冲洗液及肿瘤组织，测瘤重，固定标本作石蜡切片，HE染色，组织学观察。（注：TES为E．coli DNA缓冲液，组成为Tris-HCl，EDTA，NaCl）

腹腔注射（IP）方案：将荷瘤小鼠随机分3组：TES组、CY组、DNA组，于接种后第2d，3组分别腹腔注射TES液、CY液（1.5mg／ml）、DNA液各0.3ml，隔2日1次，共8次，余处置同前。

局部实体瘤生长抑制率的计算：

抑制率＝（阳性对照组平均瘤重－实验组平均瘤重）／阴性对照组平均瘤重×100％

1.2.4E．coliDNA对荷瘤小鼠生存期的影响：采用SC和IL两种途径，各分2组，即TES组、DNA组，接种后第4d，分别注射TES、DNA各0.3ml，隔日1次，共8次，观察小鼠生存率（90d内仍存活）和死亡鼠的平均生存时间。

1.2.5E．coli DNA体外直接细胞毒作用测定^［5］：取HCaF16A₃、Yac-1、Hela、J62，调细胞浓度为2×10⁴／ml，实验孔加E．coli DNA分别至终浓度为100、50、25μg／ml，阴性对照孔加TES，各设3个复孔，MTT比色法测定吸光度（OD值），检测波长595nm，参考波长655nm，按公式计算抑制率：

抑制率＝（1－实验孔OD值／阴性对照孔OD值）×100％

1.2.6免疫指标的测定：

荷瘤小鼠脾脏NK细胞与腹腔MΦ细胞（NK／MΦ）细胞毒活性的测定：常规制备脾脏细胞和腹腔MΦ细胞，调整效应细胞浓度分别为NK细胞5×10⁶／ml、MΦ细胞1×10⁶／ml，靶细胞浓度分别为HCaF16A₃1×10⁶／ml，Yac－12×10⁶／ml，将效、靶细胞加入96孔板，各设3个复孔，MTT比色法测定OD值，按公式计算NK／MΦ细胞杀伤活性。

NK／MΦ细胞杀伤活性（％）＝［1－（A_（E＋T）－A_（E））／A_（T）］×100％

荷瘤小鼠血清内γ-INF，TNF-α活性测定：应用人γ-INFELISA试剂盒，人TNF-α ELISA试剂盒测定，均采用双抗体夹心酶联免疫检测法，结果经计算机处理（SAS软件，92版），得到血清中γ-IFN，TNF-α含量。

E．coli DNA对正常小鼠脾脏NK细胞杀伤活性影响的测定：将10只正常小鼠随机分两组：TES组、DNA组，IP途径分别注射TES、DNA各0.3ml，隔2日1次，共8次，末次注射24h后处死小鼠取脾，同前法测NK细胞杀伤活性。

1.3统计方法本实验数值为计量资料，两组生存期之间比较采用Logrank-test，其它数据中多组两两比较，采用q-test；两组比较，采用student-t-test（α＝0.05）。结果均以±s（均数±标准差）形式给出。

2结果

2.1E．coli DNA体内抑瘤实验

2.1.1E．coli DNA体内抑瘤率与病理切片中坏死面积的差别：各组小鼠肿瘤大小见图1～2。E．coli DNA体内注射后，肿瘤明显被抑制，经IL途径，DNA组瘤重（0.85±0.67g）比TES组（1.76±0.65g）减少（P＜0.05）；阳性药物BCG组瘤重（1.82±1.34 g）大于TES组瘤重。经IP途径，DNA组瘤重（0.97±0.85g）比TES组（3.24±0.83g）明显减少（P＜0.01）；阳性药物CY与DNA的作用无显著差异（P＞0.05）。经IL，IP两种途径，E．coli DNA抑瘤率分别为51.7％，70.06％；同时病理切片可见DNA组肿瘤组织坏死面积大于相应阳性对照药物组，大于相应TES组，与抑瘤率基本吻合。经IL途径的阳性对照药物BCG作用后，瘤重大于TES组，而病理切片中见BCG组肿瘤坏死面积大于TES组。

图1IL途径，TES、BCG、DNA 3组小鼠肿瘤大小的比较

Fig1ThetumorsizeofTES，BCGandDNAgroupsbyILway

图2IP途径，TES、CY、DNA 3组小鼠肿瘤大小的比较

Fig2ThetumorsizeofTES，BCGandDNAgroupsbyIPway

2.1.2E．coli DNA对荷瘤小鼠生存期的影响：E．coli DNA能显著延长存活时间，经SC途径，DNA组平均存活56.00±7．07d，较对照组（21.25±5．70d）有显著延长（P＜0.01）；于IL途径，DNA组平均存活52.00±2．74d，较对照组（21.36±5．50d）也有显著延长（P＜0.01）。而两种注射途径（SC／IL）之间的存活率无显著性差异（P＞0.05）。

2.2E．coli DNA体外直接细胞毒作用比较表1

结果表明：E．coli DNA对肿瘤细胞的直接作用与TES无显著差异（P＞0.05），提示E．coli DNA体外对肿瘤细胞无直接杀伤作用。

表1E．coli DNA体外直接细胞毒作用OD（±s）