［摘要］目的鉴定细胞凋亡的一个重要生化指标是凋亡细胞的核DNA通过琼脂糖凝胶电泳呈现典现的DNA“梯状”图谱。传统分离凋亡细胞片段化DNA的方法多采用酚／氯仿抽提。因此，有必要探寻一种更为灵敏、简单的分离凋亡片段化DNA的新方法。方法通过比较传统分离凋亡片段化DNA的方法，并对HERRMANN等^［1］报道的方法加以改进。结果本文介绍一种快速分离凋亡DNA片段化的新方法（NP-40法）。结论这种简单、快速的分离方法无需酚／氯仿反复抽提，无需大量的细胞样品，并且凋亡DNA片段化梯状图谱清晰,适用于大多数凋亡细胞片段化DNA的分离。

［中图分类号］R371-33；Q781［文献标识码］A

［文章编号］1000-8861（2000）03-0228-04

A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments

XIONG Shi-qin，ZHU Xi-hua，HUANG Yun-hui

（Department of Immunology，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

［Abstract］Objective An important biochemical index of determination of apoptosis is the hallmark of apoptotic DNA ladder by sepharose gel electrophoresis.The phenol／chloroform extraction procedure was mostly used in the conventional methods of isolation apoptotic DNA fragments.So，it is absolutely necessary that we should explore a more sensitive and more sophisticated method of isolation the apoptotic DNA fragments.MethodsWe made a comparision among the conventional methods for isolation of apoptotic DNA fragements，and improved the method reported by HERRMANN^［1］.ResultsA rapid and simple method of isolation the apoptotic DNA fragments was introduced in this paper.ConclusionThe new method works without time consuming organic extractions and a great number of cell samples.Smear of genomic DNA，which blurs the conventional apoptotic ladder is strongly reduced.The reproducible technique is suitable for the isolation of apoptotic DNA fragments in most apoptotic cell types.

［Key words］apoptosis；DNA fragmentation；nonidet P40 method

细胞凋亡（亦称程序化细胞死亡，PCD）是复细胞生物的一种普遍生理现象。它不仅参与机体的生长、发育、分化，而且与人体多种疾病如肝炎、肿瘤 、AIDS、自身免疫性疾病、卒中、阿尔茨海默氏（Alzheimers）病等密切相关。人们研究细胞凋亡的方法常包括凋亡形态学观察法、生物化学特征法、流式细胞仪法以及分子生物学方法（TUNEL法）等。由于细胞凋亡时，核小体断裂形成的多个180～200bp的寡核苷酸碎片经含溴化乙碇的琼脂糖凝胶电泳呈典型的“梯状”条带，因此鉴定细胞凋亡的一个重要生化指标是观察其核DNA经琼脂糖凝胶电泳是否呈现典型的DNA“梯状”图谱。传统分离凋亡DNA片段的方法多采用酚／氯仿反复抽提，其电泳结果常呈现模糊片状的条带背景，从而易将凋亡与坏死相混淆。另外传统方法耗时较长，有机试剂抽提步骤繁琐，所需细胞样品数目较多（大于10⁶个／ml），得率也较低。我们对HERMANN等报道的方法加以改进，通过与文献［2］和文献［3］报道的方法加以比较，提出一种新的分离凋亡DNA片段的简单方法，现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞培养：Jurkat、CTLL-2细胞按本室常规培养，采用抗体结合补体方法分离^［4～6］小鼠CD4^＋T细胞。上述3种细胞均在含10％小牛血清的RPMI1640培养液37°C、5％CO₂条件下培养，倒置显微镜计数。

1.1.2主要试剂：SEB（金黄色葡萄球菌肠毒素B，Sigma），rIL-2（本室提供），anti-Apo-1抗体由德国Krammer教授惠赠，NP-40（Fluka），RNase A及蛋白酶K购于Promega公司。兔抗鼠CD4：RPE购自Serotec公司。纯化抗鼠CD8购自Pharmingen公司（深圳晶美公司代理）。碘化丙啶（Propidiumiodide，PI，Sigma）。其它常规试剂均为分析纯。

1.2主要方法

1.2.1细胞凋亡的诱导：①参照文献［7］建立SEB诱导CD4^＋T淋巴细胞的凋亡模型。②参照文献［8］建立anti-Apo-1诱导Jurkat细胞的凋亡模型。③剥离CTLL-2细胞培养液中的IL-2，建立CTLL-2细胞的凋亡模型。

1.2.2细胞凋亡的定量分析：采用PI染色法进行细胞凋亡的流式细胞仪定量分析^［9］。

1.2.3采用NP-40法分离凋亡细胞的片段化DNA：①采用pH7.2，0.1mol／L的磷酸盐缓冲液清洗2遍，离心收集细胞（大于10⁵个／ml）。②采用150ul溶破缓冲液（1％NP-40in20mmolEDTA，蛋白酶K2μg／μl，50mmolTris-HCl，pH7.5）溶破沉淀细胞5h，至混合物变得清亮。③8 000r／min离心15min收集上清，用等量的溶破缓冲液重复抽提一次。④上清置于等量的1％SDS溶液，混匀。用终浓度为2μg／μl的RNase A，56°C处理2h。⑤用终浓度为2μg／μl的蛋白酶K37°C水浴消化3～5h。⑥添加1／2体积的10mol／L醋酸铵和2倍体积的冰冷无水乙醇，摇匀后－20°C过夜或置于液氮2h。⑦15000r／min离心30min、沉淀DNA，用75％的冰冷乙醇漂洗去除残余的盐。⑧采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳2～3h，拍照、记录结果。

1.2.4凋亡细胞片段化DNA的分离：采用文献［2］介绍的方法分离凋亡细胞的DNA片段

1.2.5凋亡细胞片段化DNA的分离：采用文献［3］介绍的方法分离凋亡细胞的DNA片段

2结果

2.1NP-40法与2种传统方法分离凋亡细胞DNA的比较采用超抗原SEB（2μg／ml）再次刺激静息的CD4^＋ T细胞（10⁶／ml）4，8，16和24h后，收获细胞。按照文献［2］和文献［3］的方法分离CD4^＋T细胞凋亡DNA片段，经1.8％琼脂糖凝胶电泳，结果分别如图1A 和图1B所示。按文献［2］推荐的方法分离的凋亡DNA片段经琼脂糖凝胶电泳未能呈现明显的DNA梯状图谱，更接近细胞坏死时所呈现的模糊片状样图谱（见图1A）。按文献［3］推荐的方法分离的凋亡DNA片段经琼脂糖凝胶电泳未能呈现典型的DNA梯状图谱。然而采用NP-40法分离的凋亡DNA片段经琼脂糖凝胶电泳结果呈现典型的凋亡DNA梯状图谱（见图1C）。提示；采用NP-40法比较传统方法分离细胞凋亡DNA片段的产量得到较大提高，凋亡细胞基因组DNA片状样对典型的凋亡DNA梯状样的影响大大减少。

图13种方法制备SEB诱导CD4^＋T细胞凋亡片段化DNA的比较

Fig1Comparison of three methods for the preparation

of CD4^＋ T cell apoptotic DNA fragments by SEB

A：M：DNA Marker（λ DNA／EcoR Ⅰ＋HindⅢ）； 1：4h； 2：8h； 3：16h； 4：24h

B：M：DNA Marker（λ DNA／EcoR Ⅰ＋HindⅢ）； 1：4h； 2：8h； 3：16h； 4：24h

C：M：DNA Marker（λ DNA／EcoR Ⅰ＋HindⅢ）； 1：8h； 2：4h； 3：16h； 4：24h

2.2NP-0法具有较高的分离效率采用NP-40法分离调亡细胞片段化DNA大大减少了按传统方法分离凋亡细胞DNA在琼脂糖凝胶电泳时，凋亡细胞大片段DNA和坏死细胞DNA对凋亡细胞片段化DNA电泳“梯状”图谱的影响。因为采用NP-40法分离的凋亡片段化DNA能够大部分从上清中得到回收，然而完整染色体留在沉淀物中。很可能采用NP-40溶破缓冲液能够溶解凋亡细胞核，然而活细胞的细胞核保持完整，因而在低速离心过程中，沉积在沉淀中。实验结果表明：对沉淀物和上清液进行处理后各自电泳，沉淀物不含有凋亡片段化DNA，而上清液中出现大量的凋亡片段化DNA（见图2）。

图2NP-40法制备SEB诱导CD4^＋T细胞凋亡上清和沉淀物所含凋亡片段化DNA的比较

Fig2Comparison of apoptotic DNA fragments in supernatant and

pellet of NP-40 lysates for CD4^＋ T cell apoptosis induced by SEB

M：DNA marker（λ DNA／EcoR Ⅰ＋HindⅢ）

1，3：supernatant；2，4：pellet；1，2：16h；3，4：8h

2.3NP-40法的细胞样品需要量NP-40法分离凋亡片段化DNA比较传统方法所需细胞数目较少。在1×10⁷～5×10<