［摘要］目的研究人直肠癌和结肠癌的肿瘤浸润γδT淋巴细胞（γδTILs）体外抗肿瘤活性。方法用固相抗体法体外扩增获得γδTILs，并用MTT法和³H-TdR掺入实验体外观察γδTILs对同种异体和异种肿瘤细胞的细胞毒及增殖反应。结果所获得γδTILs对所测定的肿瘤细胞显示出明显的细胞毒活性。该杀伤效应可为IL-2，IL-4，IL-12，IL-15，TNF-α和IFN-γ所增强，而不受IL-10，GM-CSF和TGF-β所影响。某些去增殖活性的肿瘤细胞可诱导静息化的γδTILs产生显著的增殖反应。结论γδTILs可通过其强烈的肿瘤细胞毒参与机体的抗肿瘤免疫应答。

［中图分类号］R739.8［文献标志码］A

［文章编号］1000-8861（2000）03-0175-04

Study on antitumor activity of expanded human infiltrating gamma-delta T lymphocytes

CHEN Juan，HE Wei，BA De-nian

（Department of Immunology，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences amd School of Basic Medicine，Peking Union Medical College，Beijing 100005，China）

［Abstract］Objective To investigate the antitumor activity of selectively expanded human colorectal γδ tumor-infiltrating T lymphocytes（TILs）in vitro.MethodsγδTILs were expanded by solid phase-antibody method，whose cytolytic and proliferative activities were detected by MTT method and ³H-TdR incorporation.Results Expanded γδTILs demonstrated marked cytotoxicites to allogeneic and isogeneic tumor cell lines.Cytokines including IL-2，IL-4，IL-12，IL-15，TNF-α and INF-γ could promote the cytotoxicities of γδTILs，while IL-10，GM-CSF and TGF-β had no effect on such killing activities.Rested γδTILs could proliferate in response to some mitomycin C-treated tumor cells.ConclusionsγδTILs could play an important role in antitumor response via their cytotoxicity to tumor cells.

［Key words］tumor；tumor infiltrating lymphocytes；γδT cells；cytotoxicity；cytokine

T细胞可依据表面抗原受体（TCR）的不同表达而分成两类T细胞：TCRαβT细胞和TCRγδT细胞。在外周血、脾和淋巴结T淋巴细胞中，γδT细胞所占比例较小，而在表皮及粘膜等上皮组织相对富集，据推测它们可能参与构成机体免疫监视系统的第一道防线^［1］。有研究结果显示，在上皮性肿瘤组织中局部浸润淋巴细胞也发现有一定比例的γδT细胞的存在^［2，3］。因此，澄清肿瘤浸润γδT淋巴细胞（γδTILs）的性质与功能特点将有助于最终阐释γδT细胞的生物学意义并深化抗肿瘤免疫机制的研究。我们先前进行了肠道γδTILs的体外扩增建系、表型分析和初步的功能研究^［4，5］。本文着重研究肠道γδTILs对同种异体和异种肿瘤细胞的杀伤活性，分析细胞因子对其影响作用；同时观察这些肿瘤细胞对肠道γδTILs的增殖诱导作用，以期为阐明γδTILs的功能特性提供资料和为日后可能的临床应用奠定实验基础。

1材料和方法

1.1试剂及标本

1.1.1人肿瘤组织标本：结肠癌和直肠癌标本取自中国医学科学院肿瘤医院病理科及北京协和医院外科，均为术后新鲜标本。病人术前未经放、化疗治疗。

1.1.2细胞株：人直肠腺癌细胞系HR8348购自中国医学科学院肿瘤研究所，人Burkitt's淋巴瘤细胞系Daudi及小鼠胸腺瘤细胞系EL-4（H-2K^d）为本室自存。

1.1.3主要试剂：人类基因工程重组细胞因子IL-4，IL-12，IL-15，IL-10和TGF-β购自英国PeproTech公司，TNF-α，INF-γ和IL-2购自邦定公司。丝裂霉素C（MMC），四甲基偶氮唑蓝（MTT，配成5mg／ml溶液）购自Sigma公司。氚标记的胸腺嘧啶核苷（³H-TdR）购自中科院原子能研究所，比放射活性3700kBq／ml。含10％脐带血清的RPMI1640的完全培养基（RPMI1640干粉系GIBC0—BRL公司产品，脐带血取自北京市妇产医院，0.22μm滤膜过滤除菌）。抗TCRγδ单克隆抗体和荧光标记的单克隆抗体：抗TCR-αβ-PE（IgG2b，cloneBMA031），抗TCR-γδ-FITC（IgGl，cloneIMMU510）为法国IMMUNOTECH公司产品。

1.2方法

1.2.1固相抗体活化和扩增肿瘤浸润γδTILs及αβTILs和其纯度鉴定：参见文献［4］。

1.2.2细胞毒活性测定：MTT法检测扩增的γδTILs对肿瘤细胞系HR8348，Daudi和EL-4的杀伤活性。效应细胞分别为αβTILs或γδTILs。效靶比分别为1∶5，1∶1和5∶1。具体实验步骤参见文献［5］。

1.2.3细胞因子对γδTILs肿瘤细胞毒活性影响测定：γδTILs的静息化处理：取培养中的γδTILs用RPMI1640培养基离心（500×g）洗涤3次，用完全培养基重悬并置于37°C、5％CO₂孵箱中静息24h。将细胞因子IL-2（10ng／ml），IL-4（10ng／ml），IL-10（10ng／ml），IL-12（10ng／ml），IL-15（10ng／ml），TGF-β（0.5ng／ml），TNF-α（200ng／ml），GM-CSF（0.5ng／ml）和INF-γ（200ng／ml）分别与静息化的γδTILs孵育过夜。次日检测其对三种靶细胞的细胞毒活性。

1.2.4γδTILs增殖活性测定：静息化的γδTILs作为效应细胞，加入96孔圆底培养板中（1×10⁵细胞／孔）。剌激细胞为经不同浓度MMC（50μg／ml，25μg／ml，120μg／ml）分别处理（37°C，30min）去增殖活性的HR8348，Daudi和EL-4肿瘤细胞（1×10⁶细胞／ml），按剌激细胞与效应细胞之比为1∶2，1∶5，1∶10加入培养板中。总体积为200μl／孔。在37°C、5％CO₂孵箱中培养24h后，每孔加入³H-TdR10μl，继续培养8h。收集细胞，用β液闪仪测定掺入量，以每分钟脉冲数（cpm）表示。

1.2.5统计学处理：采用t检验增殖反应的显著性；采用χ²检验细胞杀伤百分率的显著性。

2结果

2.1扩增所得γδΤILs的纯度鉴定体外固相抗体扩增法培养的细胞在1～2周内开始增殖，4～6周达到对数生长期，其中γδTILs的比例随时间逐渐上升，在3周时达到80％以上（见图1）。每份肿瘤标本可获得10⁸以上的γδTILs。用抗CD3单抗固相扩增可得到αβTILs占绝大比例（＞90％）的总T细胞。

图1体外扩增所得γδTILs的纯度的代表性分析

Fig1Representative analysis for purification of expanded γδTILs in vitro

γδ or αβ TILs derived from same case of patient with colon carcinoma were stained with anti-TCR-αβ-PE and anti-TCR-γδ-FITC McAbs respectively.This figure is shown as a re-presentative of similar independent tests from 10 cases.

2.2γδTILs对同种异体和异种肿瘤细胞系的细胞毒作用我们比较了同一标本来源的γδTILs和αβTILs的杀伤能力。如图2所示，γδTILs对异种小鼠胸腺瘤EL-4细胞的杀伤活性明显高于αβTILs（在E∶T范围为1∶1～1∶5之间时，P＜0.05）；对于同种异体肿瘤细胞HR8348，αβTILs杀伤活性强于γδTILs（P＜0.05）；而对于Daudi细胞，两者无明显差异（P＞0.05）。γδTILs的肿瘤杀伤强度由高到低依次为Daudi，EL-4和HR8348。

图2γδTILs和αβTILs对同种异体／异种肿瘤细胞的体外杀伤活性

Fig 2Cytotoxicity of γδTILs and αβTILs to allogeneic／xenogeneic tumor cell lines in vitro Killing activities of TILs to murine thymoma EL-4（A），human colon adenocarnoma HR8348（B）and human lymphoma Daudi（C）tumor cell lines were measured at E∶T ratio of 1∶5，1∶1 or 5∶1，respectively.Data are expressed as ±s（％）from 3 cases.

2.3各种细胞因子对γδTILs肿瘤杀伤活性的影响如图3所示，在效靶比为5∶1的情况下，IL-2，IL-4，IL-12，IL-15，TNF-α和IFN-γ能增强γδTILs对三种靶细胞的杀伤能力，而IL-10，GM-CSF和TGF-β对其则无明显影响作用。

图3细胞因子对γδTILs杀伤EL-4，HR8348和Daudi肿瘤细胞的影响（效靶比为5∶1）

Fig3Effects of varied cytokines on cytotoxicity of γδTILs to EL-4<