［摘要］目的为搞清GAM在gp130介导的信号传导中所起的作用。方法选择在IL-6刺激下出现分化和增殖抑制的M1细胞系，分别用正向和反向插入GAM cDNA的真核表达载体pEF-BOS与pSV2-neo质粒共转染，经G418选择培养筛选得到稳定转染的细胞，并用半套式PCR方法证实了GAM基因与这两种细胞基因组DNA的整合。结果流式细胞仪分析表明正向GAM cDNA转染的M1细胞中GAM的表达水平明显升高，³H掺入实验表明GAM表达水平升高使M1细胞对IL-6的反应性下降。结论GAM高表达M1细胞的建立为深入研究GAM在gp130介导的信号传导中的作用提供了良好的实验模型。

［中图分类号］R186［文献标识码］A

［文章编号］1000-8861（2000）03-0179-04

Establishment and verificatin of GAM cDNA stably transfected M1 cell line

LIU Fei，LIU Yin，JIN Bo-quan，ZHU Yong，CHEN Li-hua，ZHANG Jian-ping

（Department of Immunology，the forth Military Medical University，Xi’an 710032，China）

［Abstract］ Objective To investigate the role of GAM gp130 associated molecule in the gp130 mediated signaling.Me-thods Under the stimulation of IL-6 and sIL-6R，whose signal is transducted by gp130，M1 cells，a murine myeloid leukemia cell line，go into growth arrest.To investigate the role of GAM in the gp130 mediated signaling，the mammalian expressing vector pEF-BOS containing GAM cDNA or anti-sense cDNA of GAM was constructed and transfected permanently into the M1 cells.Nest-PCR and flow cytometric analysis verified the stable transfectants and increased level of GAM.Resulst The increase of GAM expression inhibited the growth arrest effect of IL-6 on M1 cells significantly，while the decreasing of GAM enhanced this effect slightly.Conclusion These results indicated that GAM might play a role of negative regulator in gp130 signaling.

［Key words］gp130；signal transduction； gene transfection

gp130是白细胞介素6（IL-6）、IL-11、白血病抑制因子（LIF）、抑瘤素M（OSM）和心肌营养因子1（CT-1）等多种细胞因子受体中的共用信号传导链，在体内分布广泛，具有多种重要功能。已知JAK-Stat途径和MAPK途径均参与gp130的信号传导，但其调控过程尚未完全搞清^［1］。gp130结合分子（gp130 associatedmolecule，GAM）是以gp130胞浆区-GST融合蛋白为探针筛选人胎盘cDNA文库而得到的分子，其cDNA全长为1.6kb，具有一个588个核苷酸的开放读框，编码一个由196个氨基酸组成、分子量为24kDa的蛋白分子^［2］。Nothern印迹表明人体多种脏器，包括心、肝、脾、肺、肾、脑、胰腺、骨骼肌、胎盘和睾丸等，均有GAM分子的表达。已证实体内GAM与gp130胞浆区近膜部分结合。GAM与JAK激酶和gp130分子在COS细胞中的共同表达可抑制JAK激酶与gp130的结合及这两者的磷酸化，而GAM分子本身无论有无IL-6刺激均未见有磷酸化现象^［3］。从目前对GAM及其同源分子的研究结果推测，该分子可能通过蛋白质相互作用的形式参与gp130的信号传导。为探讨GAM在gp130介导的信号传导中所起的作用，我们选择在IL-6刺激下出现分化和增殖抑制的M1细胞系，用插入GAM cDNA的真核表达载体pEF-BOS与pSV2-neo质粒共转染，以观察GAM表达水平对M1细胞IL-6反应性的影响。

1材料与方法

1.1主要材料M1细胞系为本室冻存的标准细胞株，正向和反向插入GAM cDNA的真核表达载体pEF-BOS（正向插入者称为pO，反向插入者称为pR）、pSV2-Neo质粒及上述质粒转化的DH5α菌均由本室自备^［4］。脂质体Dosper购自宝灵曼公司。PCR引物P1、P2和P3均采用Steve Rozen等人的Primer3程序自行设计、P1、P2针对pEF-BOS中外源基因插入区（即填充区）的上下游，P3针对GAMcDNA5′端第431-450位碱基序列（见图1），由上海生工公司合成。引物序列P1：TTCTCAAGCC-TCAGACAGTGG；P2：GATACTCTCAAGGGTC-CCAGG；P3：CCTGCTAATCCGACTTCTCG。

图1pEF-BOS-GAM的Pst I酶切位点及PCR引物位置

Fig 1Pst I sites and PCR primers locations in pEF-BOS-GAM

The PCR product of pOby P₃＋P₂ is 288bp，the amplified product of pR by P₁＋P₃ is 258bp.

1.2质粒的制备、纯化与鉴定分别扩增pEF-BOS空载体、pO、pR或pSV2-Neo质粒转化的DH5α菌，用碱裂解法大量制备质粒，聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA。紫外分光光度法测定纯化产物的纯度与含量，用PstI酶切鉴定3种不同的pEF-BOS质粒。

1.3M1细胞基因转染与筛选培养将处于对数生长期的M1细胞接种于6孔板中，纯化的pSV2-Neo质粒分别与pR或pO质粒按1∶10的比例混匀，按操作手册在脂质体Dosper介导下转染M1细胞。转染后48h开始用含0.8g／L G418的相应培养液筛选3周。筛选出的耐药细胞株改用含0.2g／LG418的DMEM培养液，并通过有限稀释法进行克隆化。

1.4半套式PCR鉴定稳定转染的细胞株每种耐药克隆各收集5×10⁵个细胞，离心、洗涤后加去离子水0.2ml煮沸3min离心，取20μl上清液做半套式PCR，即用引物P1、P2扩增后，再分别用引物P1＋P3或P3＋P2扩增。PCR条件为（1）95°C 8min；（2）95°C 1min；（3）52°C 1min；（4）72°C 1.5min；（5）重复2～4步29个循环；（6）72°C 5min。同时取微量pO或pR质粒进行PCR扩增作为阳性对照。PCR结束后1.5％琼脂糖电泳观察结果。

1.5流式细胞仪检测鉴定GAM重组体分别收集亲本M1细胞和各种转染的M1细胞，4％多聚甲醛4°C固定10min，0.1％皂角素-PBS室温下处理10min，加入GAM特异性单抗4E3^［5］4°C孵育30min，0.1％皂角素-PBS充分洗涤后，再加入FITC标记的羊抗鼠IgG 4°C孵育30min，同上洗涤后，用美国Coulter公司ELITE ESP型流式细胞仪检测。

1.6GAM稳定转染的M1细胞对IL-6的反应性亲本M1细胞和各种转染的M1细胞在不同浓度IL-6作用48h后，加入³H-TdR再培养8h后收集细胞，用美国Beckman公司LS6500型液闪记数仪测定β射线cpm值，以未经IL-6刺激细胞的cpm值为100％计算³H掺入率cpm％。

2结果

2.1质粒的纯化与鉴定纯化的质粒OD260∶OD280均为1.80。用PstI酶切各种pEF-BOS质粒所得结果与预期相符。

2.2GAM稳定转染细胞系的建立及半套式PCR检测鉴定pEF-BOS-GAM与pSV2共转染的M1细胞经3周的G418筛选及有限稀释后得到单克隆来源的耐药细胞株。上述耐药细胞经煮沸处理后取上清液行半套式PCR检测，各种pEF-BOS质粒转染细胞的扩增结果中与相应质粒得到的结果一致（见图2）。

图2半套式PCR检测鉴定GAM稳定转染的M1细胞

Fig2Identification of GAM stable transfected M1 cells by semi-nest PCR

lane 1，2：products of pO amplified with P₃＋P₂ or P₁＋P₃ respectivly

lane 3，4：PCR procudts of pO transfected M₁ cells amplified

with （P₁＋P₂，P₃＋P₂）or （P₁＋P₂，P₁＋P₃） respectivly.

lane 5：DNA marker（1543，994，695，515，377，237bp）

lane 6，7：PCR products of pR transfected M₁ cells amplified

with （P₁＋P₂，P₃＋P₂） or （P₁＋P₂，P₁＋P₃） respectivly.

lane 8，9：PCR products of pR amplified with P₁＋P₃ or P₃＋P₂ respectively.

2.3GAM重组体中GAM分子的表达水平流式细胞仪分析表明，pO转染的M1细胞中，GAM分子的表达水平明显高于亲本M1细胞及空载体或pR转染细胞（P＜0.01），而pR转染的M1细胞中，GAM表达水平略低于亲本M1细胞与空载体转染细胞（见图3）。