摘要：目的了解重症肌无力(MG)特异性细胞免疫应答情况。方法采用酶链免疫吸附试验(ELISA)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结合狭缝印迹杂交检测MG患者及健康对照者的PBMC和胸腺细胞AChR刺激后IFNγ和IL4的表达及转录，并对行胸腺摘除(Tx)者进行了随访。结果总MG患者组PBMC IFN-γ表达高于对照,尤以急性MG更著。增生的胸腺细胞IFN-γ、IL—4转录和IL-4的表达高于对照，胸腺细胞和PBMC的IL-4转录明显相关。Tx1周后PBMC IL-4的表达减少,1月后IFN-γ转录下降。结论 MG患者体内存在特异性细胞免疫活化和细胞因子网络的失衡，PBMC有些免疫学参数能反映胸腺的免疫学改变；胸腺增生和胸腺瘤的MG发病机制可能不同；Tx及其后应用糖皮质类固醇治疗是必要的。

分类号：R746．1;R322．5文献标识码：A

文章编号：1000-8861(2000)02-0116-05

Specifie cell-Mediated Immune Response in Myasthenia Gravis

GUO Hong ,SUN Hong ,XU xian-hao ,WANG Hong ,ZHANG Hun ,LI Bao-lin(Department of Neurology,Bejing Hospital,the Ministry of Health,Beijing 100730)

Abstract：Objective to explore the specific ce11-mediated immune response in the patients with myathenia gravis (MG).Methods IFN-γand IL-4 secreted by peripheral blood mononuclear cells(PBMC)and thymocytes in MG patients and healthy controls were determined with ELISA．IFN-γand iL-4 mRNA were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)after cultured with the stimulation of human nocontinic acetlcholine receptor.The IFN-γ and IL-4expression were monitored in MG patients with Thymectomy(Tx)．Results the expression of IFN-γby PBMC was significartly elevated on all MG pattents，especlally more higher in the acute stage，The transcription of IFN-γand IL-4,IL-4 secretion from thymocytes in MG patients with thymic hyperplasia was high．IL-4 mRNA in thymocytes was well correlated with that in PBMC．IL-4 secretion declined one week after Tx while IFN-γ mRNA decreased one month after tx.Conclusions There was an activation of specific cell-mediated immunity and an imbalance of cytokines from Th1 and TH2 in MG patients．Some of the immune parameters in PBMC might reflect the immun alterations in the thymus from MG panents．The immune mechanism of MG patients with hyperplasia is differnet from that thymoma.Thymectomy followed by treatment with a-drenocorticosteroid is necessary for MG pattents．

Keywords：myathenia gravis;IFN-γ;IL-4

重症肌无力(MyastheniaGravis,MG)是乙酰胆碱受体抗体(AchRAb)针对神经肌肉接头交触后膜上AChR进行破坏而引起的1种获得性自身免疫疾病，曾一度认为体液免疫异常是MG的唯一致病因素，但近年来越来越多的研究表明细胞免疫也参与了MG的发病过程。象其它自身免疫疾病一样，MG的发源地至今不明，但目前认为胸腺的可能性最大。因为约75%的MG患者伴有胸腺异常，其中85%为胸腺增生，15%为胸腺瘤[1];研究还发现，MG患者增生的胸腺内存在大量AChR特异应答性T、B细胞，且远较外周血为多[2];胸腺细胞可表达IL-2、IL-1、IL-6等细胞因子[3,4]提示MG患者胸腺存在免疫学改变。临床发现胸腺摘除(Tx)后，多数患者病情好转,但Tx并非对所有MG患者均有效,有些伴胸腺瘤患者甚至于Tx后会加重[5]，还有一部分MG患者胸腺病理正常，MG患者的PBMC是否存在细胞免疫的活化，不同病理表现MG患者的胸腺组织细胞免疫活性是否也有差异，外周血相应的免疫参数是否能够反映胸腺的免疫学变化，Tx后PBMC的细胞活性有否变化，弄清这些问题，不仅有利于对MG发源地的进一步认识，而且有利于治疗方案的个体化。根据表达细胞因子的不同，将辅助性T细胞(Th)分为Th1和Th2两个亚类，IFN-γ主要由Th1表达，IL-4主要由Th2表达。本文检测了30例MG患者的PBMC、10例行Tx的MG患者胸腺和外周血单个核细胞在特异性抗原AChR刺激下IFN-γ、IL-4mRNA的表达情况，同时检测了细胞培养上清液中2种细胞因子的蛋白表达情况，并与健康对照组进行比较，试图在分子水平上，从细胞因子角度了解MG患者外周血和胸腺细胞的免疫活性情况。

1材料与方法 1.1研究对象所有进入研究的均为北京医院神经科根据临床表现、新斯的明试验、血清AChRAb测定、肌电图重复电刺激和单纤维肌电图检查确诊的MG患者。取PBMC用于检测者30例，男16例、女14例，年龄13～66(38．2±15．8)岁，病程50d～12(3．1±3．6)年，其中14例为初发3个月或复发1个月以内的患者，根据改良的Osserman分型：Ⅰ、Ⅱa、Ⅰb、Ⅱ和Ⅳ型分别为1、6、16、2和5例。于胸外科行Tx的MG患者10例,男6例，女4例，年龄13～57(38．3±15．9)岁，病程50d～(1．35±1.57)年，Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ和Ⅳ型分别为0、2、4、3和1例。术前行纵隔CT检查，报告：胸腺增生4例，胸腺瘤2例,正常萎缩3例,另1例未能确定胸腺瘤或增生。Tx后病理证实：2例为胸腺瘤,余8例均为胸腺增生。1例曾用糖皮质类固醇激素治疗，并于术前将激素减量至15mg/d，余9例均未曾用过免疫治疗，10例患者于术后第9d拆线，于第10d进行大剂量糖皮质类固醇激素冲击治疗。

健康对照组：20名外周血取自北京医院职工、学生或患者家属，男、女各10名，年龄25～48(35.2±7．4)岁;4例正常胸腺取自先天性心脏病患者行开胸手术者(阜外医院)，男、女各2例，年龄9～39(24．5±14．3)岁。

1．2实验方法 1.2．1外周血及胸腺单个核细胞的分离及培养：取肝素静脉抗凝血10ml，用淋巴细胞分离液提取单个核细胞；取手术摘除之胸腺，生理盐水冲洗干净后，剪碎，筛网过滤，分散成单个细胞，用淋巴细胞分离液提取单个核细胞；行Tx的MG患者于Tx当日、术后1周、2周及术后1个月分别取静脉抗凝血10ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，并于当天进行临床评分。

粗提的人腓肠肌AChR[5],采用“固相抗原法”纯化[7]。将单个核细胞加入到结合有AChR的96孔细胞培养板中，每孔3×105个细胞，在37℃，5％CO2孵育6h后，收集部分细胞，其余继续培养，48h后离心，收集上清液，冻于-80℃备用。1．2．2RT—PCR结合狭缝印迹杂交检测IFN-γ和IL-4的Mrna表达：一步法提取细胞总RNA。于每份RNA中加鸟型逆转录酶(AMV)15U,置42℃水浴1h，得到逆转录产物Cdna，进行PCR扩增。在洁净的Eppendorf管中依次加入MgCl2(25mmol／L)、4种Dntp混合物(2．5mmol／L)、上下游引物(15μmol／L)、cDNA5μl,总体积25μl。95％℃预变性5min，加入1μTaqDNA聚合酶，在热循环仪(PTC-51B，军事医学科学院)上进行PCR反应，条件为：94℃变性30s，72℃延伸45s，退火温度分别为：IFN-γ54.5℃，IL-458℃，β-actin65℃，均为30s。循环35次,72℃延伸10min。反应产物于1．5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

IFN-γ、IL-4和β-actin的PCR引物寡核苷酸序列的5'和3’端依次为CAGCTCTGCATCGTTTTGGGG和ACTGGGATACTCTTCGACCT;CCCCTCTGTTCTTCCTGCTA和CTCTGGTTGGCTTCCTTCA；GTGGGGCGCCCCAGGCACCA和CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC； 将PCR产物95℃变性后经狭缝加样器点样于硝酸纤维素膜。取出膜，预杂交后,加DIG标记的探针(BoehringerMannheim)杂交，充分洗膜，封闭，加抗DIG抗体反应30min，加入新配制的底物工作液，避光反应1h，用Tris-EDTA终止反应。结果用激光密度扫描仪检测。

1．2．3结果计算：以“相对单位”表示PCR扩增产物的量。Β-actin作为内对照。计算公式如下： 1.3统计学处理使用Excel7．O统计软件，用t检验，相关回归等处理有关资料。2结果 2．1MG患者PBMC经ACMC刺激后IFN-γmRNA转录和表达见表1。

表1MG患者PBMC中IFN-γmRNA转录和表达 Tab1ExpressionandtranscriptionofIFN-γinPBMC 0．01)，其中10例IFN-γ值高于正常均值±2s(30．2±19．8)，健康对照组只有1例高于此上限。

2．2MG患者PBMC经ACMC经AChR激后IL-4Mrna转录和表达见表2。

表2MG患者PBMC中IL-4Mrna转录和表达 Tab2ExpressionandtranscriptionofIL—4inPBMC *P＜0.05，**P＜0.01，Comparedwithcontrol PDMC与AChR共同孵育后，经RT—PCR结合狭缝印迹杂交，检测30例MG患者IPN-γmRNA转录虽高于对照组，但无显著意义(P＝0．43)。而14例急性期MG患者的IFN-γmRAN转录高于对照组(P＜0．01)。患者组IFN-γ表达量高于健康对照组(P＜0．05),14例急性MG患者更明显(P＜ 表3胸腺细胞和PBMC的IFN-γMrna转录和表达 *P＜0.05，**P＜0．01，Comparedwithcontrol PBMC的IL-4Mrna转录和表达，无论在30例MG患者还是其中14例急性期患者，与对照组比较均无显著差异(P＞0．05)。

2．3胸腺细胞和PBMC的IFN—γMrna转录和表达情况见表3。

10例MG患者胸腺单个核细胞经AChR刺激 Tab3ExpressionandtranscriptionofIFN-γinThymocytesandPBMC *P＜0．05，ComparedwithControl 后，IFN-γmRNA转录及表达虽高于健康对照，但无统计学差异(P＞0．05)，进一步分析其中8例病理报告为增生者,发现胸腺和外周血的单个核细胞IFN-γMrna转录均高于健康对照(P＜