摘要：目的观察硫代反义寡核苷酸(S-ASODN)体外对HDV的抑制作用：方法在HDV/HBV感染人胎肝细胞中加入不同浓度的针对HDV Stem Ⅰ区684～698位核苷酸的15聚S-ASODN，分别采用ELISA和班点杂交法检测上清液中HDAg和细胞中HDV rNA。结果 HBsAg、HDAg在感染后第2d至第16d均可测出，以第4d至第12d达高峰。加入S-ASODN(2、4、6μmol／L)后2d,肝细胞中HDV复制受到抑制，培养上清中HDAg分泌量也减少,其抑制率呈剂量依赖关系；在同等剂量时(4μmol／L),S-ASODN作用2d、4d、6d，对HDV抑制率大至相同。结论 hDV在原代培养人胎肝细胞中能稳定复制和表达至少达1Zd；S-ASODN能有效抑制HDV/HBV感染人胎肝细胞中HDV复制与表达。本研究为进—步在动物体内研究S-A-SODN抗HDV作用和向临床过渡提供了有益的实验依据。

分类号：R392文献标识码：A

文章编号：1000-8861(2000)02-0125-04

Inhibitory effect of HDV by antisense phosphorothioate oligodeoxynu-cleotide in vitro

JIANG Yie-gui Null ,MAO qing(Centre of Infectious Diseases,Southwest Hospital,the Third Military Medical university,Chongqing.400038)

wANG Sheng-qi(Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences.Beijing100850，China)

wANG Yu-ming(Centre of Infectious Diseases,Southwest Hospital,the Third Military Medical university,Chongqing.400038)

Abstract：Objective to study inhibitory effect of replication and expression of HDV by antisense phosphorotioate oligodeoxynucleotide(S-ASODN)．Methods a15-mer antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide(S-ASODN)was complementary to stem-Ⅰregion(nuclectide 684～698％)was added to edium of HDV/HBV-infected human fetal hepatocytes.HDAg and HDV RNA were detected by ELISA,is situ hybridization and dot blot hybridization.Results HDAg，HBsAg could be de-tected from day 2 to day 16 after HDV/HBV-infection.Secretion of hDAg reached summit from day 4 to day 12 intertion．Dav2 after S-ASODN(2、4、6μmol/L)was added into the medium of hepatoeytes,HDV RNA was inhibited，Secretion of HDAg in the supernant was reduced．Inhibitory rate showed the feature of dosage dependence．Conclusion primary human fe-tal hepatocyte is competent for infection with HDV/HBV，HDV can stably replicate and express in human tetal hepatocytes，and at least this replication and expression can reach for 12 days．S-ASODN can availably inhibit replication and expression of HDV in HDV/HBV-infected human fetal hepatocytes．This study may he valuble for further research in animal and in clinic use．

Keywords：Antisense phosphorotaioate oligodeoxynucleotied；Hepatitis d virus；HDV/HBV co-infection;Human fetal hepatocyte

HDV采取“双滚环方式”进行复制[1]，核酶在HDV的复制过程中起着重要作用。已经证实以HDV基因链核酶为靶序列，针对不同功能区的A-SODN在分子水平能不同程度地抑制核酶的自裂,其中互补于核酶的自裂点和StemⅠ区者，几手可完全抑制核酶的自裂[2]。本研究在其基础上观察其硫代修饰物(S-ASODN)在HDV/HBV感染人胎肝细胞中对HDV复制与表达的抑制作用。

1材料与方法 1.1人胎肝细胞人工流产22周龄胎儿肝脏，经体外两步灌流法分离肝细胞，台盼蓝染色细胞成活率达90%以上用于实验。

1.2HDV／HBV感染血清HBV感染血清取自本科慢性乙型肝炎患者，EUSA检测HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗-Hec(+)，血清斑点杂交HBVDAN(+),甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒标志均为阴性。HDV感染血清取自本科丁型肝炎患者，ELISA检测、HDAg(+)、抗-HD(+)，血清斑点杂交HDVRNA(+)。

1．3硫代反义寡核苷酸互补于HDV基同链核酶自裂位点和stemⅠ区684～696位核苷酸的15聚ASODN(5’-CATGCCGGCCATCAG-3’)的合成在DNA合成仪上自动完成，硫代修饰ASODN采用TETD/乙氰法，高效薄层色谱法纯化。同时合成15聚核苷酸同源链(5’-CTGATGTCCGGCATG-3’)及M13(5‘-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)测序引物，作正义核苷酸及非互补随机核苷酸对照。

1.4实验方法 1．4.1实验分组：实验分为4组：S-ASODN治疗组(group1)、正义核苷酸对照组(group2)、随机序列对照组(group3)和空白对照组(group4)，每组24孔。

1.4.2实验步骤：将分离的人胎肝细胞用含10%小牛血清(FBS)的1640培养液调整细胞浓度为4×105/ml，接种于24孔塑料培养板内，每孔含培养液0．5ml(即每孔含细胞数为2×105个)，每24h更换培养液。培养48h后，于培养液中同时加入HEV、HDV感染血清(终浓度均为10%)，并在培养液中加入4％聚乙二醇(PEG)。37℃培养16h(过夜)后，弃去上清液,细胞用1640培养液洗涤3次后(最后1次洗涤液留样待检),加入含10%FBS和2%二甲基亚枫(DM50)的新鲜1640培养液(不含PEG)，每48h更换培养液(培养液组成同前)。每48h收集上清液和肝细胞。利用上述建立的HDV／HBV感染人胎肝细胞培养系统，在加入感染血清16h，并经3次洗涤后加入不同浓度核苷酸。S-ASODN组设2、4、6μmol/L3个终浓度,其它各组终浓度均为4μmol／L。在加入核苷酸后2、4、6d分别收集上清液和细胞。

1.5检测指标及方法培养上清液中HBsAg、HDAg检测，采用ELISA法，细胞中HBsAg、HDAg检测,采用免疫组化SP法，细胞中HBVDNA、HDVRNA检测，采用原位杂交法和斑点杂交法，细胞总RNA提取采用异硫氰酸胍一步法快速抽提。培养上清液中HBVDNAHDVRNA检测，采用斑点杂交法。同时设阳性对照、阴性对照、空白对照和替代对照。

1.6结果分析及统计学处理 1.6.1上清液中HBsAg、HDAg检测结果在酶联免疫检测仪上于450nm处测各孔光密度(OD值)。HDAg抑制率公式为： 1.6．2细胞中的HBsAg、HDAg检测：阳性呈黄褐色，阴性不显色。

1.6．3原位杂交检测HBVDNA和HDVRNA：阳性呈紫蓝色,阴性不显色。

1．6.4细胞中HDVCdna斑点杂交：阳性呈紫蓝色,阴性不显色。阳性结果进行薄层色谱扫描，得出阳性面积比，细胞中HDVRNA抑制率公式为： 全部数据经数理统计PDA-2进行方差分析，全部数据以x-±s，表示。

2结果 2．1HDV、HBV在人胎肝细胞中稳定复制表达留存洗涤液中HBsAg、HDAg均早阴性，感染后所有留存系列上清液中HBsAg、HDAg均呈阳性，HBsAg、HDAg在感染后第2d至第16d均可测出,以第4d至第12d达高峰(见图1)。免疫组化检测细胞中HBsAg、HDAg均呈阳性表达(见图2、图3)，空白对照组均呈阴性表达。原位杂交HBVDNA、HDVRNA均呈阳性表达。上清中HBVDNA和HDVRNA斑点杂交也均呈阳性表达。

图1上清中HBsAg和HDAg含量的动态曲线 Fig1DynamiccurveofHBsAgandHDAginsupernant 2．2S-ASODN抑制作用的序列特异性各组药物按4μmol／L加入培养细胞，48h后检测上清中HDAg。S-ASODN对HDAgG的抑制率为62．01%，正义核苷酸、随机序列核苷酸对HDAg无抑制作用(见表1)。提示S-ASODN抑制作用是其特异性封闭靶序列的结果。图2HDVHBV感染人胎肝细胞中HBsAg表达(S-P400)

Fig2ExpressionofHBsAginhumanfetalhepatocyteswithHADHBVinfection(S-P400)

图3HDV/HBV感染人胎肝细胞中HDAg表达(S-P400)

Fig3ExpressionofHDAginhumanfetalhepatocyteswithHDV/HBVinfection(S-P400)

表1各组药物对HDAg的影响 Tab1EffectofHDASbymedicineineachgroup *P＜0．01ascomparedwithcontrolgroup 2．3S-ASOND抑制作用的持续时间于给药后2d、4d、6d分别检测S-ASODN(4μmol/L)组8个标本上清中HDAg和细胞中HDVRNA(见表2)。3个时相抑制率相近，提示S-ASOND1次给药后抑制效应可持续6d以上。

表2S-ASODN不同作用时间对HDAg和HDVRNA的抑制作用 Tab2InhibitoryeffectofHDAgandHDVRNAbyS-ASODNindifferenttime 2．4S-ASODN对HDV的抑制作用呈剂量依赖性加入不同浓度的S-ASODN于HDV/HBV感染人胎肝细胞培养系统中，随着5-ASODN浓度的增加,人胎肝细胞表达HDAg和HDVRNA逐渐减弱(见表3、4、5)。提示：S-ASODN对HDVRNA和HDAg抑制作用呈剂量依赖性。

表3S-ASODN作用2d对HDAg和HDVRNA的抑制作用 Tab3InhibitoryeffectofHDAgandHDVRNAbyS-ASODNafter2days *P＜0．01ascomparedwithcontrolgroup 表4S-ASODN作用4d对HDAg和HDVRNA的抑制作用 Tab4InhibitoryeffectofHDAgandHDVRNAbyS-ASODNafter4days *P＜0.01ascomparedwithcontrolgroup表5S-ASODN作用6d对HDAg和HADRNA的抑制作用 Tab5InhibitoryeffectofHDAgandHDVRNAbyS-ASODNafter6days *P＜0.01ascomparedwithcontrolgroup 3讨论 目前，有关S-ASOND抗HDV作用的研究,主要是利用HDV基因转染细胞株，但这些细胞株不能完全模拟人体内肝细胞的生物学功能，用于研究S-ASOND抗HDV作用时，不能完全