摘要：目的从蛋白酪氨酸激酶(PTKs)信号传递系统及细胞周期调控这一角度来探讨胆固醇缺乏抑制Jurkat细胞增殖的分子机制。方法采用间接免疫荧光染色、流式细胞仪分析技术及免疫细胞化学染色等方法做相关分析。结果经去脂血清培养基培养的Jurkat细胞加lovastatin处理3d后，3H-TdR掺入率明显下降，细胞增殖受抑，细胞受阻于Go/G1期，PTK活性及细胞cyclin dl、CDK4蛋白的表达明显降低，加入LDL可以部分逆转上述变化。结论无论是内源性还是外源性胆固醇的缺乏都能使Jurkat细胞cyclin dl、CDK4蛋白表达降低，PTK活性下降，推测这一变化与细胞Go/G1期阻滞及细胞增殖受抑有直接关系。

分类号：R329．25；R591文献标识码：A

文章编号：1000-8861(2000)02-0108-04

Effect of cholesterol deficiency on the proliferation of Jurkat cells and its molecular mechanisms

ZHOU Dong-ming ,MI Man-tian,XU Hong-Xia ,WEI Na ,ZHANG Qian-yong ,YANG Zhi-xiang(Department of Nutrition and Food Hygiene，the third Military Medical University,Chongqing 400038，China)

Abstract：Objective the molecular mechanisms of cholesterol deficiency on the proliferation of T lymphocytes was in-vestigated from the aspect of protein throsine kinases(PTKs)signal transductions and cell cycle control．Methods3H-TdR incorporation test．Indirect immunofluorescent stain，FCM and ICC stain were used in the study．Results cellular proliferation was inhihited and blocked on Go/G1 phase，the activity of PTKs was decreased and the expression of cyclin D1，CDK4 proteins were down-regulated in Jurkat cells after treated with lovastatin for3d．When treated with LDL，they could partly increased.Conclusion The decrease of the activity of PTKs and the down-regulation of cyclin D1，CDK4 proteins may be related to the effects of cholesterol deficiency on proliferation of Jurkat cells．

Keywords：cholesterol;lovastatin;Jurkat cell；protein throsine kinase；cell cycle

细胞膜是细胞内外环境的屏障，膜脂代谢及伴随的膜特性的变化被认为是细胞对刺激产生效应的早期事件，是启动细胞反应的信号，它们与细胞的信号接收、跨膜信号传递以及后续的细胞代谢和功能的变化密切相关。哺乳动物细胞周期进程涉及细胞因子、细胞周期调控蛋白及其依赖性激酶、pRb等许多因素，它们之间相互作用，构成一级联调控网络，共同参与调控细胞周期进程[1～3]；其中cyclinD1/CDK4复合物被认为是G1期调控的关键因子，与细胞周期Go/G1期阻滞及细胞增殖受抑关系密切[4]。胆固醇(cholesterol)作为哺乳动物细胞膜上的主要成份,对细胞的生长增殖及细胞膜的功能特性起关键的调节作用。有研究显示，细胞内胆固醇缺乏，细胞生长受抑，同时发生表型改变[5]。有关胆固醇影响细胞增殖的详细分子机制尚不十分清楚。为了探讨细胞胆固醇缺乏阻遏细胞增殖的分子机制，我们研究了胆固醇缺乏对Jurkat细胞PTK信号传递系统及cyclinD1和CDK4蛋白表达水平的影响。

1材料与方法 1.1细胞株的培养JurkatT淋巴细胞株由本校免疫学教研室提供。细胞分别在含10%热灭活小牛血清或含10％去脂血清(AES)的RPMI1640培养液中常规培养传代。

1．2去脂血清的制备参照CORWIN等[6]方法，在-20℃条件下,将小牛血清：丙酮(1：9)混合去脂，过滤后将沉淀于真空干燥器内干燥过夜,干粉末用Hanks严衡液溶解，离心去沉淀，取上清过滤除菌即获得去脂、包括去除胆固醇的血清(AES)。

1.3LDL及Iovastatin处理lovastatin 1．4实验分组①正常血清组，②去脂血清+LDL组，③去脂血清组，④去脂血清+lovastatin+LDL组，⑤去脂血清+lovastatin组。

1.5抗体兔抗p34CDK4、鼠抗cyclinD1及P-Tvr单抗均为SantaCruz生物工程公司产品；SP试剂盒为Zymed公司产品；PVDF膜为美国杜邦公司产品。

1.63H—TdR掺入实验细胞经正常血清、去脂血清、去脂血清加lovastatin和(或)LDL培养72h,于收获细胞前6h加入3H-TdR(0.5μCi／孔)，常规收获细胞，测cpm值。

1.7细胞周期分析细胞经不同因素处理1～3d，每日收获各组细胞，碘化丙啶染色后用流式细胞仪对DNA进行定量分析，再结合计算机软件推算出各细胞周期相细胞所占比例。

1.8蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性间接免疫荧光分析细胞经不同因素处理72h，收获细胞，乙醇固定。细胞悬于PBA(含1%BSA，0．1%NaN3、0．3%TritonX-100的PBS)溶液中4℃封闭30min。离心后分别加入用PBA稀释的抗酪氨酸磷酸化单抗lgG．4℃过夜，加入FITC标记的释稀二抗室温避光孵育60min，悬于PBS溶液中，上流式细胞仪分析各组细胞平均荧光强度。

1.9免疫细胞化学染色经不同因素处理3d后的各组细胞，涂片，4％多聚甲醛固定．0．3%H2O2甲醇溶液封闭，10％山羊血清孵育，加一抗4℃孵育过夜(用0．01mol/LPBS代替一抗进行阴性对照实验),再与生物素标记的二抗及链霉素亲生物素-过氧化物酶反应，用含0．05%DAB+0．03%CoCl2+0．03%H2O2的0．01mol／LTris-Cl(pH7．4)缓冲液显色。

2结果 2．1细胞胆固醇缺乏对JurkatT淋巴细胞增殖功能的影响图1显示：细胞经AES培养基加不同因素处理3d后，可使细胞DNA的合成受到不同程度的抑制,不论是内源性还是外源性胆固醇的缺乏，都 A:control；B：Aes+LDL;C:AES;D:AES+lovastatin+ LDL；E；AES+lovastatin *P＜0.01vscontrol;△P＜0．01vsAES+lovastatingroup 图1细胞胆固醇缺乏对JurkatT淋巴细胞3H—TdR掺入的影响 Fig1Effectofcholesteroldeficiencyonthe3H-TdRIncorporationrateinJurkatcells 可使T淋巴细胞DNA合成受到明显抑制,3H-TdR掺入量下降，各处理组与对照组比较有显著差异(P＜0．01)，其中去脂血清加lovastatin组的DNA合成受到的抑制最为明显。若加入一定剂量(10μg/ml)LDL则可部分恢复DNA的合成作用，与AES+lovastatin组比较相差非常显著(P＜0．01)。说明胆固醇缺乏可影响Jurkat细胞的增值，胆固醇缺乏越明显，细胞增殖受抑也越显著。

2．2细胞胆固醇缺乏对JurkatT淋巴细胞细胞周期分布的影响细胞周期分析表明,用去脂血清培养的各处理组细胞，细胞生长明显低于正常血清组,Go/G1期细胞数明显增加,而S期细胞数明显减少，细胞处理3d后，对照组约有52%的细胞处于S期或G2/M期，而AES-lovastatin组和AES±lovastatin+LDL组分别有81.7%及61.3%的细胞处于Go/G1期(见图2)，表明细胞内胆固醇不足将导致细胞受阻于Go/G1期，细胞增殖受抑。

图2细胞胆固醇缺乏对JurkatT淋巴细胞细胞周期的影响 Fig2EffectofclolesteroldeficieucyonthececlyofJu-rkatcells 2．2细胞胆固醇缺乏对JurkatT淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性的影响本研究用间接免疫荧光法分析酪氨酸磷酸化蛋白的含量来间接反映PTKs活性,以探讨细胞胆固醇缺乏对Jurkat细胞PTKs信号传导系统的影响。结果表明：细胞经不同因素处理1～3d，与正常血清组比较，各处理细胞组平均荧光强度(反映所测蛋白含量)明显降低，处理3d后，AES+LDL组、AES组、AES+LDL+lovas-tatin组和AES+lovastatin组细胞平均荧光强度分别比对照组下降41%、52％、54%和69%(见图3)，免疫细胞化学染色也得到类似的结果,PTKs蛋白阳性反应物主要集中在胞膜及胞浆(见图4、图5)。说明细胞胆固醇缺乏可能通过干扰PTKs的活性而影响Jurkat细胞的信号传递。

2．4细胞胆固醇缺乏对JurkatT淋巴细胞cyclinD1、CDK4蛋白表达的影响免疫细胞化学染色显示，Jurkat细胞经去脂血清加不同因素处理3d后，CyclinD1和CDK4蛋白阳性反应物均有不同程度降低，其中以去脂血清加lovastatin组的降低程度最为显著。若同时加LDL以补充外源性胆固醇,则可部分逆转这种降低趋势(见图6、图7)。免疫印迹分析也可得到类似结果。

A：control；B：AES-LDL；C:AES；D：AES-lovastatin-LDL；E：AES+lovastatin 图3细胞胆固醇缺乏对JurkatT淋巴细胞PTKs活性的影响 Fig3EffectofcholesteroldeficiencyontheactivityofPTKsinJurkatcells 图4未处理的正常细胞PTKs蛋白强阳性(×400)

Fig4ICCstainingofPTKsproteinuntreatedJurkatcellsshowingIntensivepositivity(×400)

图5细胞经AES+lovastatin培养3d后PTKs蛋白呈阳性(×400)

Fig5ICCstainingofPTKsproteininJurkatcellstreatedwithAES+lovastatinfor3d，showingpositivity(×400)

图6未处理的正常细胞CDK4蛋白强阳性(×400)

Fig6ICCstainingofCDK4proteininuntreatedJurkatcells，showingIntensivepositivity(×400)

图7细胞经AES+lovastatin+LDL培养3d后CDK4蛋白呈