摘要：目的研究tuftsin及其抑制物的化学合成和对巨噬细胞抗胆管癌作用的影响。方法用多肽合成仪合成tuftsin及抑制物后,用毛细管电泳片检测它们的浓度，用其怍用于分离的大鼠脾巨噬细胞和肝脏Kupffer细胞，再取细胞上清液怍用于胆管癌细胞，并测定上清液中的TNF和NO含量。结果合成的tuftsin及抑制物纯度在99.9%以上，tuftsin及抑制物可分别刺激和抑制巨噬细胞杀伤胆管癌细胞，并分别促进和抑制巨噬细胞分泌TNF和NO。结论 tuftsin是一种较强的巨噬细胞刺激因子。

分类号：R378．21；R657．6文献标识码：A

文章编号：1000-8861(2000)02-0112-04

The chemical synthesis of tuftsin and its inhibiting analog and their in-fluence to Mφ relaing anti-Cholangiocarcinoma cells

LEI Xin ,HAN Ben-li(Hapatobillary Surgery Center，Southwest hospital．The third Military Medical University Chongqing 400038，China)

Abstract：Objective to researche the Chimical synthesis of tuftsin and its inhibiting analog and the their influence to Mφ relating anti-cholangiocarcinoma cells.Methods Tuftsin and its inhibiting analog were synthesized by peptide synthesizer．Then．The purity of their were tested by capillary electrophgsis．Moreover．They were used to stimulating the seperated splenic M and Kupffer cells in rats．The supernatants of which were mixed with cholangiocacinome cells and the concentration of TNF and No in supertats were measurel．Results the purity of tuftsin and its inhibiting analog reached more than 99.9%，Tuftsin and its inhibiting analog could stimulate and inhibite Mφ cholanglocarcinoma cells respectively.Moreover,they could promote and inhibite Mφ to secreate TNF and NO．Conclusion tuftsin is a stimulating factor of Mφ

Keywords：tuftsin；chemical synthesis；splenic mφ;Kupffer cells

tuftsin是免疫球蛋白IgG的Fc段在脾脏内羧基肽酶和白细胞表面的白细胞膜溶解酶切割作用下产生的一种4个氨基酸的多肽，它可促进粒细胞、巨噬细胞等细胞的吞噬、分泌作用[1～3]。它具有杀菌、抗肿瘤等广泛的生物学作用[4～5]。世界上已有多个国家用多种方法合成tuftsin成功。但国内由于种种原因，还未见化学合成tuftsin的报道[4～6]。本研究拟化学合成tuftsin及其抑制物,并将其作用于大鼠脾巨噬细胞和肝脏Kupffer细胞，从而全面研究其功能。

1材料与方法 1．1tuftsin的化学合成tuftsin的合成是在ABI431A自动肽上进行。采用Fmoc方案，起始采用0．0125mmol／L树脂酸(美国ABI公司),按照Thr-Lys-Pro-Arg的序列使肽链从C端逐个向N端延伸。各种氨基酸的保护基团是：各氨基酸的α-氨基为Fmoc保护，其它侧链保护基团为Thy(TrT)，Lys(Boc)，Arg(PMC)。每步缩合都加入HoBt／Dcc保护氨基tuftsin的合成，缩合后用含有20％六氢吡啶的NMR溶液去除Fmoc保护基。肽链合成后，按照ABI公司推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴条件下的混合反应液中，反应液的成分为结晶苯酚0．75ml，酒石酸乙二胺(EDT)0．25ml，苯硫基甲烷(thionaisole)0．5ml，去离子水0．5ml，三氟乙酸10ml。在室温条件下持续搅拌,tuftsin的反应时间为4.5h，使肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基。将混合液经受4G的玻璃滤器过滤以滤掉切下的树脂及保护基团，并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至1～2ml，加乙醚50ml使多肽沉淀后,经6G玻璃滤器过滤后，冷冻干燥，所得便是多肽成品。

1．2tuftsin的鉴定将tuftsin少量产品用去离子水溶解后，用0．2μm纤维滤膜过滤后，用BioFo-CUS-3000型毛细管电泳仪采用区带电泳法进行分析,毛细管采用孔径25cm，长度46cm，缓冲液采用Ph2．8磷酸盐缓冲液，电泳方向从正极向负极移动，恒定电压10kV。

1.3tuftsin抑制物的合成按照Nishioka提供的结构,Thr-Lys-Pro-Pro-Arg，按照上述方法，从C端逐个向N端连接每个氨基酸。其它处理同上。

1.4tuftsin抑制物的纯度鉴定将tuftsin抑制物少量产品用去离子水溶解，余步骤同1．2。

1.5大鼠脾巨噬细胞和肝脏Kupffer细胞的分离无菌状态下取大鼠脾脏，充分剪碎后用200孔滤网分离脾巨噬细胞，用门静脉灌洗，胶原酶消化的方法分离肝脏Kupffer细胞。

1.6tuftsin及抑制物的作用把脾巨噬细胞和Kupffer细胞分别分成tuftsin作用组、tuftsin作用组S(Sigma的tuftsin产品，下同)。抑制物作用组为先加抑制物竞争性结合tuftsin受体，然后再加tuftsin刺激，以上各组均用1640培养液作对照组，共6组，每组6孔。每孔各加0．1ml相应的工作液，对照组加0．1ml1640培养液。每孔各含合成tuftsin和Sigma的tuftsin及抑制物2．5、6、1．5μg。作用24h后，分别收集细胞上清液，置于-20℃冰箱保存备用。

1．7tuftsin对胆管癌细胞的直接作用把上述调配好的胆管癌细胞置于24孔板中，每孔0．1ml继续培养，当细胞达到50%融合时，换成3%FCS的培养液,加不同浓度的tuftsin，对照组加相同量的培养液。作用24h后，用上述3H-TdR掺入法测其cpm。

1.8tuftsin和其抑制物作用于脾巨噬细胞和Kupffer细胞后，细胞上清液成分的抗胆管癌作用把传代培养的胆管癌细胞用含10%FCS的DMEM培养基调配成106个细胞/ml，然后把细胞置于24孔培养板中,每孔0．1ml，当胆管癌细胞达到50%融合时，换成含3%FCS的DMEM培养基，分别加入上述保存的细胞上清液。每孔0．1ml。上清液及tuftsin作用24h后，每孔加入0．1ml3H-TdR(1μCi)，让其掺入6h。然后弃去上清,用0.5%的胰蛋白酶充分消化下胆管癌细胞,加入液体闪烁液中,用液体闪烁仪测其cpm。

1．9酶联免疫法检测细胞上清液中的TNF取上述冻存细胞上清液100μl检测，具体方法略。1.10比色法测定细胞上清夜中的NO取上述冻存细胞上清液100μl检测，具体方法略。

2结果 2．1tuftsin及抑制物的纯度检测合成tuftsin(见图1)经积分运算，主峰面积占所有面积的99．9%以上，合成的tuftsin抑制物(见图2)经积分运算，主峰面积也占所有面积的99．9％以上。因此，它们的合成效率均为99．9%,每次残基平均偶联效率为99.

图1合成tuftsin的毛细管电泳图 Fig1Thediagramofcapillaryelectrophesisforsynthe-sizedtuftsin 图2合成tuftsin抑制物的毛细管电泳图 Fig2Thediagramofcapillaryelectrophesisforsynthe-sizedtuftsininhibitinganalog 2．2tuftsin对胆管癌细胞的直接作用见表1。由表1可以看出，所有组之间比较均无显著性差异，表明tuftsin对胆管癌细胞的增殖没有较明显的直接抑制作用。

表1不同量tuftsin对胆管癌细胞增殖作用的影响 Tab1Theinfluenceofdifferentamounttuftsintoprolifera-tionofcholangiocarcinoma 2.3tuftisn剌激脾巨噬细胞和Kupffer细胞产生的分泌物对胆管癌细胞的影响见表2。表2中各种细胞的tuftsin组与对照组及TI组比较均有显著性差异。结果表明：tuftsin刺激上述细胞后，它们的细胞分泌物对胆管癌细胞的增殖有明显的抑制作用。但加tuftsin抑制物后，再用tuftsin刺激上述细胞，细胞分泌物对胆管癌细胞没有明显的抑制作用。表2tuftsin和抑制物刺激巨噬细胞产物对胆管癌细胞增殖的作用(cpm，x-±s)

Tab2TheroleofproductsoftuftsinstimulatingMφtothecholangiocarcinomacellsproliferation(cpm，x±s)

表2中S为脾巨噬细胞；K为Kupffer细胞；T代表tuftsin作用组；ST为Sigma公司的tuftsin产品；C为对照组；TI为tuftsin抑制物组。

2．4tuftsin和其抑制物对脾巨噬细胞及Kupffer细胞分泌TNF的影响见表3。从表3可以得出,各种细胞的tuftsin组与对照组及TI组比较均有显著性差异。结果表明：tuftsin刺激上述细胞后，细胞分泌TNF明显增加。但加tuftsin抑制物后，再用tuftsin刺激上述细胞，细胞分泌物中TNF的含量并没有增加。

表3细胞上清液中TNF的浓度(pg，x±s)

Tab2TheconcentrationofTNFinthesupernatantsofMφ(pg,x-±s)

2．5tuftsin和其抑制物对脾巨噬细胞及Kupffer细胞分泌NO的影响见表4。表4中各种细胞的tuftsin组与对照组及TI组比较均有显著性差异。结果表明：tuftsin刺激上述细胞后，这些细胞分泌NO明显增加；但加tuftsin抑制物后，再用tuftsin刺激，细胞上清液中的NO的含量并没有显著增加。

表4细胞上清液中TNF的浓度(pg，x-±s)

Tab4TheconcentrationofNOinthesupernatantsofMφ(Pg，x±s)

3讨论 tuftsin的合成方法主要有固相合成法和液相合成法[4～6]。Tuftsin尽管只是一种4个氨基酸的小肽,但是由于这4个氨基酸的侧链游离基团比较多，如苏氨酸、赖氨酸、脯氨酸都有3个功能基团。苏氨酸除有氨基和羧基外，还有一个羟基；赖氨酸除有一个氨基外，还有一个α，β-氨基己酸；