摘要：目的观察树突状细胞(DCs )从凋亡胆管癌细胞获取抗原后，体外诱导抗肿瘤免疫应答及对胆管癌细胞的特异性免疫杀 伤效果。方法用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM- CSF)加白介素-4(IL-4)从人外周血分化、诱导DCs、γ-射线在体外诱导培 养的人胆管癌细胞凋亡，将DCs、T淋巴细胞和凋亡胆管癌细胞共培养，同时设计不同类 型肿瘤细胞(坏死胆管癌细胞及培养胆管癌细胞)作对照，7d后，分离、富集DCs、T 淋巴细胞进行免疫应答及肿瘤细胞杀伤试验。结果与 凋亡胆管癌细胞共培养之DCs可以有效提呈胆管癌细胞抗原，有强烈的免疫应答，刺激的 细胞毒T淋巴细胞(CTLs)特异性地杀伤胆管癌细胞。结论用GM-CSF加IL-4从人外周血分化、诱导的DCs能从凋亡胆管癌细胞 有效提呈肿瘤抗原并诱导出显著的杀伤胆管癌细胞的免疫反应，可望成为有效的肿瘤特异性 免疫治疗新途径。

中图分类号：R392.11文献标识码：A

Dendritic cells acquire antigen from apo ptotic hepatochlangioma cells and induce special CTLs

WU GangHAN Ben-li

(Department of Hepatobiliary， Southwest Hospital，the Third Military Medical

University，Chongqing 400038，China)

YU Hong

(E mergency Medical Center，Chongqing 400010，China)

PEI Xue-tao

(Institute of Radiation M edicine， Academy of Military Medical Sci ence， Beijing 100850， China)

Abstract：Objective To inv estiga te the ability of dendritic cells(DCs)ac quiring antigen from apoptotic hepatochl angioma cells and inducing CTLs activati on．Methods DCs were pre pared from peripherad blood mononuclear induce d with gra-nulocyt e／macrophage colony-stimulating factor(G M-CSF) and interleukin-4．Apoptosis of he patochlangioma cells were induced with γ-radiation．We design these experiment groups including(1)coculture of DCs and apoptotic cancer cells and T cells，(2)co culture of DCs and necrosis cancer cells and T cells，(3)coculture of DCs and cul tured cancer cell and T cells，(4)cocultu re of DCs and T cell，(5)cocuture of DCs and cultured cancer cell．They are cocult ured for 7 days．Results On ly DCs cocultured with apoptotic cells c an induce special CTLs，while the group o f necrosis cancer cells and culture cell s can not．Conclusions H uman de ndritic cells can efficiently present an tigen derived from apoptotic cells and s timulate special CTLs．It will probably b ecome effective especial antitumor imm unological therapeuty．

Key words：dendritic cell s(DCs)；cytotoxic T lymphocytes(CTLs)；apo p tosis；hepatochlangioma▲

树突状细胞(DCs)是专职的抗原提呈细胞，在宿主的免疫反应中起着重要作用 ^［1］。临床观察证明：不同的肿瘤存在肿瘤相关抗原(TAA)^［2］，肿瘤自 发性消失的出现证明了特异性抗肿瘤免疫的存在，但绝大多数恶性肿瘤呈进行性生长又表明 ，免疫机制不能完全有效地保护宿主^［3］。许多证据表明免疫机制失能不是由于缺 乏 肿瘤抗原而是由于这些抗原不能有效提呈给T细胞产生特异性免疫反应之故^［4］。 本实验进行了通过DCs提呈凋亡胆管癌细胞抗原并诱导特异性CTLs杀伤肿瘤细胞，通 过这一途径意欲打破肿瘤的免疫耐受，重建抗肿瘤特异性免疫反应，探索出一条有效的肿瘤 特异性免疫治疗新途径。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂：γ-射线照射源，军事医学科学院放射医学研究所⁶⁰Co 源，剂量率2.07～2.23Gy／min；淋巴细胞分离液M450，英国进口分装( 上海化学试剂厂)；CD2、CD19MagneticBeads 磁性分离试剂盒(Coulter公司)；人T淋巴细胞富集柱(R＆D公司)；鼠抗人单 克隆荧光抗体CD1a(PE)、B7(FITC)(Pharmingen公司)；培 养基(IMDM)(GibcolBrl公司)；胎牛血清(北京军区军马所)；马血清 (北京军区军马所)；重组人造血细胞生长因子(rHGFs)，GM-CSF、IL-4 (Glaco公司)。

1.1.2细胞株：QBC939胆管癌细胞(第三军医大学西南医院王曙光博士惠赠) ；HepG2肝癌细胞、IL-60白血病细胞由军事医学科学院放射医学研究所血液研究 室保存。

1.1.3人外周血：来自自愿供血者。

1.2方法

1.2.1从人外周血定向诱导分化和培养树突状细胞：人外周血肝素抗凝，4∶1比例 与0.5％甲基纤维素混匀静置约30min，将红细胞自然沉降至界限分明，吸出上层( 上 清)有核细胞部分，通过淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque)获取单个核细胞带 ；CD2、CD19免疫磁珠从单个核细胞悬液中去除T、B淋巴细胞并制成10⁵／m l的细胞浓度悬液备用；24孔培养板每孔加1mlIMDM培养基，37°C、5％C O ₂及饱和湿度的条件下，每孔单核细胞的初始浓度：2×10⁴／ml，细胞因子：G M-CSF50ng／ml、IL-4 1000ng／ml每48h加入培养体系1 次，连续4次，1周半量换液。

1.2.2从外周血分离T淋巴细胞：用T淋巴细胞富集柱从外周血中获取T淋巴细胞。

1.2.3凋亡胆管癌细胞制备：取5×10⁶胆管癌细胞4Gy照射6h使细胞出 现凋亡。

1.2.4树突状细胞吞噬凋亡小体负载抗原：IMDM培养基，37°C、5％CO 2及饱和湿度的条件下，从人外周血定向诱导分化和培养树突状细胞并在培养的第3dDC s、T淋巴细胞和凋亡胆管癌细胞共培养；为了证明凋亡是抗原交叉提呈中的重要环节，设 计了DCs、T淋巴细胞和坏死胆管癌细胞共培养组(胆管癌细胞加入低渗盐水在37°C 、5％CO₂及饱和湿度的条件下培养30min)以及正常培养的胆管癌细胞；为了证 明 DC的抗原提呈作用及免疫刺激功能，设计了T淋巴细胞和凋亡胆管癌细胞共培养组，为了 证明负载抗原后的DC刺激特异性CTLs，设计了DCs、T淋巴细胞共培养组。共培养 7d后，收集DC、T淋巴细胞备用。

1.2.5从共培养中分离、富集树突状细胞、T淋巴细胞：分别从24孔板收集DCs 、T与凋亡胆管癌细胞，DCs、T与坏死肿瘤细胞、DCs与T淋巴细胞、T淋巴细胞与 凋亡胆管癌细胞的培养液，用IMDM培养液悬浮细胞，离心(650×g，10min) 洗细胞1次，离心(200×g，10min)洗细胞2次，洗凋亡小体和坏死肿瘤细胞， 再用培养基重悬细胞，获得受凋亡胆管癌细胞和坏死胆管癌细胞刺激的DCs与T细胞；用 去T淋巴细胞的免疫磁珠法按实验手册所述的方法将T淋巴细胞、DCs分离或用人T淋巴 细胞富集柱(R＆D公司，美国)收集，分别获得T细胞、DCs备用。

1.2.6负载抗原后DCs的免疫活性：4组DCs(受凋亡胆管癌细胞刺激、坏死胆 管癌细胞刺激、正常培养的胆管癌细胞及自体T淋巴细胞的刺激)用IMDM培养基悬浮， 浓度为5×10⁵／ml，分别以1×10³／孔，5×10³／孔，1×10⁴ ／孔加入96孔圆底培养板，用单核细胞作对照组，每组各3个复孔，每孔再加入同种T细 胞1×10⁵，终体积为200μl，37°C、5％CO₂及饱和湿度的条件下 培养96h， 于培养前18h加H³-TdR，0.5μCi／孔。收集细胞，液闪计数检测cpm值 ，结果用3孔平均值表示。

1.2.7CTLs杀伤活性试验(MTT法)：按前述方法获得共培养7d后各组T淋 巴细胞，靶细胞分别是胆管癌细胞、HepG2肝癌细胞、HL-60白血病细胞，效靶 比为1∶1、15∶1、30∶1。分别以1×10⁴／孔，1.5×10⁵／孔，3 ×10⁵／孔加入96孔圆底培养板，用未受刺激的T淋巴细胞作对照组，每组各3个复 孔，每孔再加入肿瘤细胞1×10⁴／孔，终体积为200μl，37°C、5％CO 2及饱和湿度的条件下，培养4h，弃去100μl上清，加入MTT液(5mg／ml )20μl／ml，上述相同条件继续培养2h。每孔加入酸化异丙醇100μl，振荡5 min，在波长570nm处测OD值。

2结果

2.1电镜观察透射电镜可见DCs伸展的突起，胞浆中富含线粒 体，较少溶酶体，并 可见凋亡物质(凋亡小体)(见图1)；扫描电镜还拍摄到DC正在捕捉凋亡小体(见图2)；γ-射线照射促使胆管癌细胞发生凋亡并释放凋亡小体(见图3)。

图1透射电镜显示树突状细胞吞噬的凋亡小体(×7600)

Fig1Transmission electron microscopy revealed apoptotic material and body of apoptotic cell within the cytoplasm of glutaraldehyde-fixed DCs